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Améliorez votre analyse de l'acrylamide grâce à une colonne robuste et un standard interne certifié

L’acrylamide peut se former dans les aliments quand des sucres réagissent avec l’acide aminé asparagine lors de procédés de cuisson à haute température, comme la friture ou la grillade par exemple. Les aliments comme les chips, les produits à base de céréales, et le café sont des exemples de produits pour lesquels on cherche à déterminer la présence et la concentration d’acrylamide.
La présence d’acrylamide dans les aliments a été signalée pour la première fois par l’Agence Nationale Suédoise des Aliments (Swedish National Food Administration) en 2002. Suite à ce signalement, il y a eu partout dans le monde une augmentation constante des efforts afin de mieux comprendre son origine dans les aliments, l’ampleur de la contamination dans diverses denrées alimentaires et ses effets potentiels sur la santé liés à l’exposition alimentaire. L’acrylamide est classée comme substance chimique très dangereuse et il a été démontré qu’une concentration élevée d’acrylamide peut provoquer des cancers chez les animaux de laboratoire (même si aucun lien direct entre l’exposition alimentaire et l’augmentation des cancers chez l’Homme n’ait été prouvé à ce jour). Pour préserver la Santé Publique, les scientifiques ont donc besoin de méthodes d’analyse qui leur permettent de déterminer avec efficacité et précision les concentrations d’acrylamide dans les aliments et les boissons. Dans cet article, nous comparons les méthodes d’analyse typiques de l’acrylamide à une solution améliorée utilisant une colonne Allure Acrylamide et un standard interne deutéré. Les bénéfices de cette solution sont des temps d’analyse plus rapides et de plus longues séquences d’analyse sans besoin d’aucune maintenance instrumentale.

Approche analytique actuelle

La LC-MS/MS est la technique de choix

L’analyse précise de l’acrylamide dans les matrices alimentaires a présenté de nombreux challenges techniques. Au départ, la technique GC-MS/MS était la technique de base car l’acrylamide est une petite molécule, assez volatile. Cependant, cette technique reposait sur la dérivation de l’acrylamide en un compose bromé, étape que l’on préférait éviter [1]. Les méthodes ont donc été transférées en LC-MS/MS qui est alors devenue la technique de choix pour l’analyse en routine de l’acrylamide dans les matrices alimentaires. Les méthodes LC-MS/MS font tout de même encore face à des challenges analytiques, notamment sur la rétention de l’acrylamide et sa séparation des composés interférents provenant de matrices complexes dans lesquelles on cherche à l’analyser.

Utilisation de colonnes LC de Carbone Graphique Poreux (CGP)

L’Europe a normalisé une méthode d’analyse dans les aliments —EN 16618:2015— qui préconise l’utilisation d’une pré-colonne et d’une colonne analytique en carbone graphite poreux (CGP), en partie à cause de la difficulté à analyser l’acrylamide en utilisant les mécanismes traditionnels de rétention en phase inverse. Les colonnes CGP sont maintenant couramment utilisées dans l’industrie car elles retiennent suffisamment l’acrylamide pour la séparer des composés interférents provenant de la matrice qui restent présents, et ce même après une procédure de préparation d’échantillons rigoureuse comme celle décrite dans la méthode EN. La colonne CGP est également capable de travailler avec des phases mobiles 100% aqueuse, des conditions dans lesquelles de nombreuses colonnes de phase inverse subiraient le phénomène d’assèchement des pores (“dewetting”) qui a pour conséquence une perte de rétention et qui nécessite une régénération très longue de la colonne avec une phase mobile 100% organique.

Utilisation de standards internes deutérés

Une quantification précise est impérative mais la procédure d’extraction peut induire de grandes variations la méthode EN recommande donc l’utilisation de standards internes ajoutés à l’échantillon en même temps que le solvant d’extraction. La méthode EN préconise l’utilisation de standards internes deutérés à la place des standards internes marqués au carbone couramment utilisés pour l’analyse de l’acrylamide. L’acrylamide-d3 est donc le standard interne de choix, et beaucoup moins onéreux que l’acrylamide marquée au carbone.

Exigences de la méthode

Le temps total d’analyse dans la méthode EN 16618 : 2015 est de 8 minutes. Pour répondre aux exigences de la méthode, l’acrylamide ne doit pas être éluée avant 1.7 minutes, mais il est nécessaire d’ajouter du temps après son élution afin de nettoyer la colonne des composés interférents provenant de la matrice encore présents, même après la double extraction SPE décrite dans la méthode EN. Les composés de la matrice sont fortement retenus sur les colonnes CGP, et si elles ne sont pas suffisamment rincées entre chaque analyse, ces composés peuvent alors dégrader les performances chromatographiques au point de ne plus pouvoir atteindre les exigences de la méthode concernant la rétention minimale obligatoire de 1.7 minutes.

Un retour à la rétention par phase inverse peut augmenter la cadence d'analyses

Lorsque les laboratoires se rapprochent du point auquel ils ne pourront plus répondre aux exigences de la méthode, deux choix s’offrent alors à eux : soit procéder à une très longue régénération de la colonne dans l’espoir de pouvoir à nouveau répondre à ces exigences, soit remplacer la pré-colonne et éventuellement la colonne analytique. Ces deux choix sont coûteux, et ils diminuent les cadences analytiques. Passer sur une colonne Allure Acrylamide est une meilleure alternative : sa chimie de phase inverse (brevetée) incorpore un ligand polaire unique, qui retient l’acrylamide, est compatible avec des conditions 100% aqueuses, et offre des temps d’analyse plus rapides et des durées de vie de colonne plus longues que celles des colonnes CGP. Utiliser une pré-colonne et une colonne Allure Acrylamide donne la possibilité de retenir l’acrylamide assez longtemps afin de répondre aux exigences de la méthode EN, sans retenir trop fortement les composés interférents de la matrice, ce qui permet de les éliminer rapidement de la colonne entre deux analyses. En conséquence, les laboratoires travaillant avec les colonnes Allure Acrylamide peuvent analyser plus d’échantillons tout en utilisant moins de colonnes — une combinaison permettant des économies intéressantes pour tout laboratoire. Les exemples qui suivent illustrent les bénéfices à utiliser une pré-colonne et une colonne Allure Acrylamide, avec un standard interne deutéré, pour les laboratoires à haut débit d’analyses.

Temps d'analyse plus courts

Comme les composés de la matrice sortent rapidement de la colonne Allure Acrylamide, cette dernière est donc capable de s’équilibrer et d’être prête pour la prochaine injection plus rapidement qu’une colonne CGP travaillant sous conditions optimales. La figure 1 montre un exemple de deux différentes méthodes, l’une sur une colonne Allure Acrylamide et l’autre sur une colonne de type CGP. La méthode sur la colonne CGP a même été optimisée à partir de la méthode EN, en réduisant le temps d’analyse de 8 à 7 minutes tout en gardant un temps de rinçage et de rééquilibration optimal. Des rinçages supplémentaires n’améliorent pas de façon significative la durée de vie de la colonne. L’analyse de l’acrylamide sur la colonne Allure Acrylamide satisfait aux exigences de la méthode concernant la rétention minimale de 1.7 minutes, avec une bonne séparation des composés de la matrice, et avec des temps d’équilibration beaucoup plus courts. Une diminution du temps d’analyse de 2.5 minutes par rapport à la norme EN 16618:2015 et de 1.5 minutes par rapport à la méthode optimisée sur la colonne CGP, permet d’analyser plus d’échantillons par jour, augmentant donc la productivité du laboratoire.

cgarm-img — **Figure 1** : Les laboratoires peuvent augmenter leur cadence d'analyse en utilisant une colonne Allure Acrylamide car elle nécessite des temps d'équilibration plus courts que ceux nécessaires à une colonne CGP, et ce, même avec une matrice complexe comme les chips.

	Peaks	Conc. (ng/mL)	Precursor	Product
1.	Acrylamide-d3 (IS)	200	75.1	58.1
2.	Acrylamide	Endogenous	72.1	55.1

Column	See notes

Temp.:	22 °C
Standard/Sample	Acrylamide-d3
Diluent:	Water

Inj. Vol.:	10 µL
Mobile Phase	A. 0.001% Formic acid in water, B. 0.001% formic acid in acetonitrile
Flow:	0.4 mL/min

Detector	MS/MS
Ion Mode:	ESI+
Mode:	MRM
Instrument	HPLC
Sample Preparation	Extracted per EN 16618:2015 Weighed 2.0 g of homogenized potato chips into a 50 mL centrifuge tube. Added 40 mL water followed by the addition of internal standard. Shook by hand for 30 sec, by vortexer for 15 sec, and then on a mechanical shaker for 60 min set to maximum sample extraction agitation. Centrifuged in a refrigerated centrifuge at 10 °C, 3600 x g for 20 min. Removed the aqueous layer after centrifugation, taking care to avoid the top, fatty layer, or the solids at the bottom of the tube. Placed the aqueous extract in an appropriate container. For cleanup, the first SPE cartridge (multimode SPE column with nonpolar, SAX, and SCX properties, 1000 mg/6 mL) was conditioned with 3 mL methanol and x2, 6 mL aliquots of water. Passed 10 mL of the aqueous extract through the column and collected eluate. For the next cleanup step, the second SPE cartridge (crosslinked polystyrene/poly-DVB SPE column, 500 mg/6 mL) was conditioned with 5 mL methanol and 5 mL water. Passed the eluate from the previous step entirely through the column. Rinsed the loaded cartridge once with 4 mL water and discarded the rinsing solvent. Eluted the acrylamide with 2 mL of 60% methanol in water. Collected the sample and transferred into an evaporation tube. Placed the tube in an evaporator at a temperature no higher than 40 °C to remove the methanol. Evaporated until the final volume was 0.5–0.8 mL using a gentle flow of nitrogen. Transferred the final sample into an autosampler vial and analyzed by LC-MS/MS.
Notes	Column Details A. Allure Acrylamide column: 5 μm, 50 mm x 2.1 mm ID analytical column (cat.# 9167552) with 5 μm, 10 mm x 2.1 mm ID guard cartridge (cat.# 916750212). B. Porous graphitized carbon column: 5 μm, 50 mm x 2.1 mm ID analytical column with 5 μm, 10 mm x 2.1 mm ID guard cartridge. Mobile Phase Gradients (%B) A. Allure Acrylamide column: 0.00 min (0%), 1.00 min (0%), 2.00 min (90%), 2.01 min (0%), 5.50 min (0%), flow = 0.4 mL/min. B. Porous graphitized carbon column: 0.00 min (0%), 1.70 min (0%), 2.70 min (90%), 2.71 min (0%), 7.00 min (0%), flow = 0.4 mL/min.

Durée de vie des colonnes sensiblement plus longue

La figure 2 illustre la grande stabilité du temps de rétention de l’acrylamide sur la colonne Allure Acrylamide en comparaison à une colonne CGP, qui montre une perte de rétention quasi-immédiate et ne répond plus au critère de rétention de 1.7 minutes après seulement 475 injections d’un échantillon de café, extrait et purifié selon la norme EN 16618:2015. En revanche, même après 1000 injections, les performances de la colonne Allure Acrylamide restent stables et la colonne toujours prête pour la prochaine injection. La figure 3 montre la stabilité du temps de rétention de l’acrylamide de la première à la millième injection sur la colonne Allure Acrylamide. La capacité de la colonne Allure Acrylamide à éluer les composés interférents de la matrice plutôt qu’à les retenir fortement est la clé de la stabilité de ses performances sur des centaines et des centaines d’injections répétées de matrice, cela sans avoir à la régénérer ou la changer.

decorative — **Figure 2** : La colonne Allure Acrylamide répond toujours aux exigences de la norme EN 16618 : 2015 même après 1 000 injections — plus de deux fois plus d'injections que sur une colonne CGP classique..

	Peaks	Conc. (ng/mL)	Precursor	Product
1.	Acrylamide-d3 (IS)	200	75.1	58.1
2.	Acrylamide	Endogenous	72.1	55.1

Detector	MS/MS
Ion Mode:	ESI+
Mode:	MRM
Instrument	HPLC
Sample Preparation	Extracted per EN 16618:2015 Weighed 2.0 g of ground coffee into a 50 mL centrifuge tube. Added 5 mL n-hexane and 40 mL water followed by the addition of internal standard. Shook by hand for 30 sec, by vortexer for 15 sec, and then on a mechanical shaker for 60 min set to maximum sample extraction agitation. Centrifuged in a refrigerated centrifuge at 10 °C, 3600 x g for 20 min. Removed the aqueous layer after centrifugation, taking care to avoid the top, hexane layer, or the solids at the bottom of the tube. Placed the aqueous extract in an appropriate container. For cleanup, the first SPE cartridge (multimode SPE column with nonpolar, SAX and SCX properties, 1000 mg/6 mL) was conditioned with 3 mL methanol and x2, 6 mL aliquots of water. Passed 10 mL of the aqueous extract through the column and collected eluate. For the next cleanup step, the second SPE cartridge (crosslinked polystyrene/poly-DVB SPE column, 500 mg/6 mL) was conditioned with 5 mL methanol and 5 mL water. Passed the eluate from the previous step entirely through the column. Rinsed the loaded cartridge once with 4 mL water and discarded the rinsing solvent. Eluted the acrylamide with 2 mL of 60% methanol in water. Collected the sample and transferred into an evaporation tube. Placed the tube in an evaporator at a temperature no higher than 40 °C to remove the methanol. Evaporated until the final volume was 0.5–0.8 mL using a gentle flow of nitrogen. Transferred the final sample into an autosampler vial and analyzed by LC-MS/MS.

Performance reproductible de colonne à colonne

Développées pour pouvoir travailler avec des phases mobiles 100% aqueuses, les pré-colonne et colonne Restek Allure Acrylamide offrent des performances robustes d’injection à injection et de colonne-à-colonne. Nos procédés de fabrication rigoureux et nos tests stricts de contrôle qualité vous assurent d’obtenir les mêmes performances analytiques lorsque vous devrez remplacer votre colonne Allure Acrylamide (Figure 4).

	Peaks	Conc. (ng/mL)	Precursor	Product
1.	Acrylamide-d3 (IS)	200	75.1	58.1
2.	Acrylamide	200	72.1	55.1

Detector	MS/MS
Ion Mode:	ESI+
Mode:	MRM
Instrument	HPLC

Une meilleure solution pour l'analyse de l'acrylamide

Bien que les colonnes CGP préconisées par la norme EN 16618:2015 retiennent suffisamment l’acrylamide, leur forte rétention des composés provenant de la matrice a pour conséquences des temps d’équilibration plus longs et des durées de vie de colonne plus faibles. L’analyse de l’acrylamide sera plus rapide grâce aux colonnes Allure Acrylamide car elles garantissent une rétention suffisante de ce composé tout en éliminant plus efficacement les composés de la matrice. En conséquence, les exigences liées à la méthode sont maintenues sur plus d’injections, ce qui permet d’analyser plus d’échantillons avant qu’une quelconque maintenance ne soit nécessaire. En associant les pré-colonne et colonne analytique Allure Acrylamide à un standard interne deutéré, les laboratoires peuvent alors augmenter leur productivité et leur rentabilité.

Références

J.A.G. Roach, D. Andrzejewski, M.L. Gay, D. Nortrup, S.M. Musser, Rugged LC-MS/MS survey analysis for acrylamide in foods, J. Agric. Food Chem. 51 (2003) 7547−7554. https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jf0346354

FFAR3126B-FR