Analisi LC-MS/MS delle micotossine nella polvere di arachidi in 5,5 minuti

• Analisi veloce per una maggiore produttività del campione
• Una separazione eccellente migliora l'accuratezza per 12 micotossine regolamentate.
• Preparazione del campione facile e veloce (diluire-filtrare-iniettare)

Alcuni funghi che crescono sui prodotti agricoli producono metaboliti tossici noti come micotossine. I moderni processi di lavorazione degli alimenti non sono in grado di rimuovere completamente questi composti, se presenti; pertanto, sono stati stabiliti rigidi protocolli di monitoraggio. Sebbene un metodo universale per l'analisi delle micotossine permetterebbe uno screening altamente efficiente, è molto difficile svilupparne uno a causa di differenze nelle proprietà fisico-chimiche delle micotossine, nell'efficienza di estrazione e negli effetti matrice. Zhang et al. hanno pubblicato uno studio realizzato in diversi laboratori [1] volto a fornire ai laboratori una procedura analitica che potrebbe essere ampiamente applicata all'analisi di un’ampia varietà di micotossine in diverse matrici. Ispirandoci a questo lavoro, abbiamo sviluppato il seguente metodo LC-MS/MS che risolve 12 micotossine regolamentate dalla FDA entro i limiti di pressione degli strumenti HPLC tradizionali.

In questo esempio, le micotossine sono state analizzate in una matrice di polvere di arachidi. L'uso di una colonna relativamente corta, la selettività della fase stazionaria Bifenile e l'efficienza di particelle Raptor con superficie porosa da 2,7 µm hanno consentito un'eccellente e rapida separazione in 5,5 minuti (tempo ciclo totale 7 minuti). È stato osservato un composto coeluente della matrice che condivideva la più abbondante transizione MRM per la micotossina HT-2 (447,3-285,3), quindi è stata selezionata una transizione meno abbondante (447,3-345,3) per la quantificazione. Per aumentare la sensibilità, è stato usato un tampone ammonio per agevolare la ionizzazione delle micotossine. La colonna Raptor Bifenile funzionava molto bene per le 12 micotossine analizzate nello studio citato, ma per gli elenchi di composti più lunghi contenenti micotossine isobariche con strutture simili, la fase Raptor Fluorofenile può essere necessaria per fornire un'adeguata risoluzione cromatografica. La selettività della colonna Raptor Fluorofenile è dimostrata in questa analisi di 20 micotossine.

Questo metodo ha mostrato un'eccellente precisione e accuratezza per le 12 micotossine regolamentate dalla FDA che sono state valutate durante uno studio di convalida che copriva una grande varietà di matrici (comprese farine di mais e di riso integrale di varie origini, oltre alla polvere di arachidi qui mostrata). Restek desidera ringraziare il Dott. Zhang per il suo supporto tecnico nel corso del presente progetto.

	Peaks	tR (min)	Conc. (ng/g)	Precursor Ion	Product Ion 1	Product Ion 2
1.	Deoxynivalenol	0.62	50	297.3	249.3	231.2
2.	Fumonisin B1	2.45	50	722.5	352.4	334.5
3.	HT-2	2.60	50	447.3	345.3	285.3
4.	Fumonisin B3	2.85	50	706.5	336.4	318.4
5.	Fumonisin B2	3.23	50	706.5	336.3	141.2
6.	T2	3.31	50	489.3	245.2	387.4

	Peaks	tR (min)	Conc. (ng/g)	Precursor Ion	Product Ion 1	Product Ion 2
7.	Aflatoxin G2	3.74	5	331.2	313.3	189.3
8.	Zearalenone	3.96	50	319.3	283.3	187.2
9.	Aflatoxin G1	4.22	5	329.2	243.2	200.2
10.	Aflatoxin B2	4.43	5	315.3	287.3	259.2
11.	Aflatoxin B1	4.99	5	313.3	285.2	241.2
12.	Ochratoxin A	5.19	5	404.2	239.3	358.3

Matrix interference was observed for HT-2 transition 447.3-285.3 in peanut powder. Therefore, 447.3-345.3 was chose for quantification.

Column	Raptor Biphenyl (cat.# 9309A52)
Dimensions:	50 mm x 2.1 mm ID
Particle Size:	2.7 µm
Pore Size:	90 Å
Guard Column:	Raptor Biphenyl EXP guard column cartridge 5 mm, 2.1 mm ID, 2.7 µm (cat.# 9309A0252)
Temp.:	40 °C
Standard/Sample
Inj. Vol.:	5 µL
Mobile Phase
A:	Water, 2 mM ammonium formate, 0.1% formic acid
B:	Methanol, 2 mM ammonium formate, 0.1% formic acid
	Time (min) Flow (mL/min) %A %B %C 0.00 0.5 70 30 0.6 0.5 70 30 0.7 0.5 50 50 3.0 0.5 25 70 4.5 0.5 25 75 5.0 0.5 10 90 5.2 0.5 10 90 5.21 0.5 25 75 6.00 0.5 25 75 6.01 0.5 70 30 7.00 0.5 70 30

Detector	MS/MS
Ion Mode:	ESI+
Mode:	MRM
Instrument	UHPLC
Sample Preparation	Weighed 1.00 gram of peanut powder in a 50 mL centrifuge tube and added 2.00 mL of water. Vortexed at 3000 rpm for 5 min followed by the addition of 4.0 mL of extraction solvent (50:50 water:acetonitrile, v/v). The tube was then vortexed at 3000 rpm for 5 min followed by centrifugation for 15 min at 4200 rpm. 475 μL of the supernatant was filtered through a Thomson SINGLE StEP Nano filter vial (0.2 μm, cat.# 25882). The sample was then fortified with 25 μL of a standard solution prepared in water at 1000 ng/mL (100 ng/mL for aflatoxins and ochratoxin A) as part of the matrix-matched calibration curve. Vortexed at 3000 rpm for 1 min prior to analysis.
Notes	Want even better performance when analyzing metal-sensitive compounds? Check out Inert LC columns at www.restek.com/inert.

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Riferimenti

1. K. Zhang, M.R. Schaab, G. Southwood, E.R. Tor, L.S. Aston, W. Song, B. Eitzer, S. Majumdar, T. Lapainis, H. Mai, K. Tran, A. El-Demerdash, V. Vega, Y. Cai, J.W. Wong, A.J. Krynitsky, T.H. Begley, A collaborative study: determination of mycotoxins in corn, peanut butter, and wheat flour using stable isotope dilution assay (SIDA) and liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), Journal of Agricultural and Food Chemistry, 65 (33) (2017) 7138-7152. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27983809.