Analisi LC-MS/MS di fentanyl e analoghi nell’urina umana
Abstract
Gli oppioidi sintetici, tra cui fentanyl e sufentanil, presentano un elevato potere analgesico. L’abuso di questi antidolorifici da prescrizione, insieme a una varietà di analoghi illegali in rapido aumento, rappresenta un problema significativo per la salute pubblica. Nell’ambito del presente studio abbiamo sviluppato un semplice metodo dilute-and-shoot che garantisce un’analisi rapida, della durata di 3,5 minuti, di fentanyl e dei suoi analoghi (norfentanyl, acetylfentanyl, alfentanil, butyrylfentanyl, carfentanil, remifentanil e sufentanil) nell’urina umana con una colonna Raptor bifenilica in LC-MS/MS.
Introduzione
Negli ultimi anni il consumo illecito degli oppioidi sintetici è aumentato esponenzialmente, e oggi ci troviamo ad affrontare una vera e propria epidemia a livello mondiale. Le migliaia di decessi annuali dovuti a overdose di oppioidi sintetici sono dovute per la maggior parte al fentanyl e ai suoi analoghi. L’elevato potere analgesico rende le sostanze come fentanyl, alfentanil, remifentanil e sufentanil dei potenti antidolorifici dalle valide applicazioni mediche, che inducono tuttavia una grave dipendenza e sono oggetto di abuso. Per esempio, il carfentanil è un anestetico estremamente potente che viene usato come tranquillante negli animali di grandi dimensioni, soprattutto elefanti. Con una potenza 10.000 volte superiore rispetto alla morfina, è uno degli oppioidi sintetici più potenti sul mercato. All’aumento del consumo illegale di questa sostanza, nella maggior parte dei casi miscelata all’eroina, sono da attribuire numerosi decessi per overdose avvenuti a partire dal 2016. Oltre all’abuso di tali farmaci da prescrizione, l’attuale crisi degli oppioidi è alimentata da un numero crescente di analoghi illegali, tra cui l’acetylfentanyl e il butyrylfentanyl, studiati ad hoc per evadere i controlli antidroga delle forze dell’ordine.
Parallelamente all’aumento degli oppioidi in circolazione e dei decessi, si assiste alla necessità sempre più pressante di poter contare su un metodo rapido e preciso per l’analisi simultanea di fentanyl e dei suoi analoghi. Per questa ragione abbiamo sviluppato un metodo LC-MS/MS per la misurazione del fentanyl insieme a sei analoghi e un metabolita (norfentanyl) nell’urina umana (Figura 1). Una semplice preparazione dilute-and-shoot del campione è stata combinata con un’analisi cromatografica rapida (della durata di 3,5 minuti) mediante l’impiego di una colonna Raptor bifenilica. Questo metodo garantisce precisione e accuratezza nell’identificazione e quantificazione del fentanyl e dei suoi analoghi, prestandosi così a diverse applicazioni analitiche, tra cui tossicologia clinica, analisi forensi, test antidroga sul lavoro e ricerca farmaceutica.
Figura 1 : Strutture chimiche
Studio sperimentale
Preparazione del campione
Una miscela di urina umana è stata fortificata con gli analiti. Un'aliquota di 80 µL di urina è stata miscelata in un vial filtrante Thomson SINGLE StEP a 320 µL di soluzione acqua:metanolo 70:30 (diluita 5 volte) e 10 µL di standard interno (40 ng/mL in metanolo) (Restek cat.# 25895). Dopo la filtrazione con membrana PVDF da 0,2 µm, è stata eseguita l'iniezione di 5 µL in LC-MS/MS.
Standard di calibrazione e campioni di controllo qualità
Gli standard di calibrazione sono stati preparati in mix di urina umana a una concentrazione di 0,05 - 0,10 - 0,25 - 0,50 - 1,00 - 2,50 - 5,00 - 10,0 - 25,0 e 50,0 ng/mL. Sono stati preparati tre livelli di campioni QC (0,75 - 4,0 e 20 ng/ml) nella matrice per testare l'accuratezza e la precisione rispetto alle curve di calibrazione precedentemente definite. Le analisi di recupero sono state svolte in tre diversi giorni. Tutti gli standard e i campioni QC sono stati sottoposti al metodo di preparazione del campione descritto in precedenza.
L'analisi LC-MS/MS di fentanyl e dei suoi analoghi è stata realizzata con lo strumento ACQUITY UPLC abbinato a uno spettrometro di massa Waters Xevo TQ-S. Di seguito si riportano i parametri dello strumento, mentre le transizioni ioniche degli analiti sono raccolte nella Tabella I.
| Colonna analitica: | Raptor Biphenyl (5 µm, 50 mm x 2.1 mm; cat.# 9309552) | |
| Colonna di guardia: | Cartuccia per colonne di guardia Raptor bifeliniche EXP, (5 µm, 5 mm x 2.1 mm; cat.# 930950252) | |
| Fase mobile A: | 0.1% acido formico in acqua | |
| Fase mobile B: | 0.1% acido formico in acqua | |
| Gradiente | Tempo (min) | %B |
| 0.00 | 30 | |
| 2.50 | 70 | |
| 2.51 | 30 | |
| 3.50 | 30 | |
| Velocità flusso: | 0.4 mL/min | |
| Volume iniezione: | 5 µL | |
| Temperatura colonna: | 40 °C | |
| Modalità ioni: | ESI positivo | |
| Analita | Ione precursore | Ione prodotto quantificatore | Ione prodotto qualificatore | Standard interno |
|---|---|---|---|---|
| Norfentanyl | 233.27 | 84.15 | 56.06 | Norfentanyl-D5 |
| Acetyl fentanyl | 323.37 | 188.25 | 105.15 | Acetyl fentanyl-13C6 |
| Fentanyl | 337.37 | 188.26 | 105.08 | Fentanyl-D5 |
| Butyryl fentanyl | 351.43 | 188.20 | 105.15 | Carfentanil-D5 |
| Remifentanil | 377.37 | 113.15 | 317.30 | Norfentanyl-D5 |
| Sufentanil | 387.40 | 238.19 | 111.06 | Sufentanil-D5 |
| Carfentanil | 395.40 | 113.14 | 335.35 | Carfentanil-D5 |
| Alfentanil | 417.47 | 268.31 | 197.23 | Acetyl fentanyl-13C6 |
| Norfentanyl-D5 | 238.30 | 84.15 | — | — |
| Acetyl fentanyl-13C6 | 329.37 | 188.25 | — | — |
| Fentanyl-D5 | 342.47 | 188.27 | — | — |
| Sufentanil-D5 | 392.40 | 238.25 | — | — |
| Carfentanil-D5 | 400.40 | 340.41 | — | — |
Risultati e discussione
Prestazione cromatografica
Tutti gli otto analiti sono stati ben separati all'interno di un gradiente di eluizione di 2,5 min (tempo di analisi totale 3,5 min) su una colonna Raptor bifenilica (Figura 2). Non è stata rilevata una significativa interferenza della matrice che potesse ripercuotersi negativamente sulla quantificazione dei campioni di urina diluiti cinque volte. La colonna Raptor bifenilica con particelle da 5 µm impiegata nell’ambito dell’esperimento è una colonna con particelle a superficie porosa (SPP), selezionata per il metodo illustrato perché garantisce prestazioni simili alle colonne con particelle totalmente porose (FPP) dalla dimensione minore pur generando una minore contropressione di sistema.
Figura 2 : Grazie alla colonna Raptor bifenilica abbiamo ottenuto una separazione efficace di tutti i composti target presenti nell’urina, senza rilevare interferenze della matrice.
Bianco urina
Standard urina 10 ng/mL
| Peaks | tR (min) | Conc. (ng/mL) | Precursor Ion | Product Ion | Product Ion | |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 1. | Norfentanyl-d5 | 1.03 | 1 | 238.30 | 84.15 | - |
| 2. | Norfentanyl | 1.04 | 10 | 233.27 | 84.15 | 56.06 |
| 3. | Remifentanil | 1.34 | 10 | 377.37 | 113.15 | 317.30 |
| 4. | Acetyl fentanyl-13C6 | 1.69 | 1 | 329.37 | 188.25 | - |
| 5. | Acetyl fentanyl | 1.69 | 10 | 323.37 | 188.25 | 105.15 |
| 6. | Alfentanil | 1.88 | 10 | 417.47 | 268.31 | 197.23 |
| 7. | Fentanyl-d5 | 1.95 | 1 | 342.47 | 188.27 | - |
| 8. | Fentanyl | 1.96 | 10 | 337.37 | 188.26 | 105.08 |
| 9. | Carfentanil-d5 | 2.04 | 1 | 400.40 | 340.41 | - |
| 10. | Carfentanil | 2.05 | 10 | 395.40 | 113.14 | 335.35 |
| 11. | Butyryl fentanyl | 2.15 | 10 | 351.43 | 188.20 | 105.15 |
| 12. | Sufentanil-d5 | 2.25 | 1 | 392.40 | 238.25 | - |
| 13. | Sufentanil | 2.26 | 10 | 387.40 | 238.19 | 111.06 |
| Column | Raptor Biphenyl (cat.# 9309552) | ||||||||||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Dimensions: | 50 mm x 2.1 mm ID | ||||||||||||||||||||
| Particle Size: | 5 µm | ||||||||||||||||||||
| Pore Size: | 90 Å | ||||||||||||||||||||
| Guard Column: | Raptor Biphenyl EXP guard cartridge 5 mm, 2.1 mm ID, 5 µm (cat.# 930950252) | ||||||||||||||||||||
| Temp.: | 40 °C | ||||||||||||||||||||
| Standard/Sample | |||||||||||||||||||||
| Diluent: | 70:30 Water:methanol | ||||||||||||||||||||
| Inj. Vol.: | 5 µL | ||||||||||||||||||||
| Mobile Phase | |||||||||||||||||||||
| A: | 0.1% Formic acid in water | ||||||||||||||||||||
| B: | 0.1% Formic acid in methanol | ||||||||||||||||||||
|
| Detector | MS/MS |
|---|---|
| Ion Mode: | ESI+ |
| Mode: | MRM |
| Instrument | UHPLC |
| Sample Preparation | Human urine was fortified at 10 ng/mL with target analytes. An 80 μL urine aliquot was mixed with 320 μL of 70:30 water:methanol solution (5-fold dilution) and 10 μL of internal standard solution (40 ng/mL in methanol) in a Thomson SINGLE StEP filter vial (Restek cat.# 25895). After filtering through the 0.2 µm PVDF membrane, 5 μL was injected for analysis. |
Linearità
Per ogni composto è stata ottenuta una risposta lineare, con intervalli di calibrazione che includevano i livelli tipici di concentrazione monitorati a fini scientifici e per rilevare gli abusi. Usando una regressione lineare pesata 1/x (1/x² nel caso del butyrylfentanyl), la linearità della calibrazione si è attestata tra 0,05 e 50 ng/mL per fentanyl, alfentanil, acetylfentanyl, butyrylfentanyl e sufentanil; tra 0,10 e 50 ng/mL per remifentanil e tra 0,25 e 50 ng/mL per norfentanyl e carfentanil. Tutti gli analiti hanno mostrato una linearità accettabile, con valori r² pari a 0,996 o superiori (Figura 3) e deviazioni <12% (<20% nel caso degli standard a minore concentrazione).
Figura 3: Curve di calibrazione
Accuratezza e precisione
Sulla base di tre esperimenti indipendenti realizzati in diversi giorni, l’accuratezza del metodo volto ad analizzare il fentanyl e i suoi analoghi è stata dimostrata dalla percentuale dei valori di recupero, entro il 10% della concentrazione nominale di tutti i composti a ogni livello di QC. La percentuale di coefficiente di variazione si è attestata in un intervallo compreso tra 0,5% e 8,3% e tra 3,4% e 8,4% rispettivamente per i confronti intra e interday, a dimostrazione di una precisione accettabile del metodo (Tabella II).
Tabella II: Risultati di accuratezza e precisione per fentanyl e composti analoghi in campioni QC di urina.
| QC Level 1 (0.750 ng/mL) | QC Level 2 (4.00 ng/mL) | QC Level 3 (20.0 ng/mL) | |||||||
| Analyte | Average Conc. (ng/mL) | Average Accuracy (%) | %RSD | Average Conc. (ng/mL) | Average Accuracy (%) | %RSD | Average Conc. (ng/mL) | Average Accuracy (%) | %RSD |
| Acetyl fentanyl | 0.761 | 102 | 1.54 | 3.99 | 99.7 | 2.08 | 19.9 | 99.3 | 0.856 |
| Alfentanil | 0.733 | 97.6 | 3.34 | 3.96 | 98.9 | 8.38 | 20.9 | 104 | 6.73 |
| Butyryl fentanyl | 0.741 | 98.9 | 6.29 | 3.77 | 94.3 | 6.01 | 20.8 | 104 | 4.95 |
| Carfentanil | 0.757 | 101 | 7.34 | 3.76 | 94.0 | 4.64 | 20.6 | 103 | 4.24 |
| Fentanyl | 0.761 | 102 | 1.98 | 3.96 | 99.1 | 2.31 | 19.9 | 99.6 | 1.04 |
| Norfentanyl | 0.768 | 103 | 6.50 | 4.04 | 101 | 1.84 | 20.1 | 101 | 2.55 |
| Remifentanil | 0.765 | 102 | 3.42 | 3.97 | 99.2 | 3.68 | 20.8 | 104 | 4.14 |
| Sufentanil | 0.752 | 100 | 1.67 | 3.93 | 98.3 | 1.28 | 20.1 | 100 | 0.943 |
Conclusioni
È stato sviluppato un semplice metodo dilute-and-shoot finalizzato all’analisi quantitativa del fentanyl e dei suoi analoghi nell’urina umana. Il metodo analitico si è rivelato rapido, affidabile e sensibile, presentando accuratezza e precisione accettabili per l’analisi in campioni di urina. La colonna Raptor bifenilica è particolarmente adatta all’analisi di tali oppioidi sintetici e il metodo illustrato può presentare diverse applicazioni: tossicologia clinica, analisi forense, test antidroga sul lavoro e ricerca farmaceutica.