Analyse von Pestizidrückständen in pflanzlichen Inhaltsstoffen mittels 
Triple-Quadrupol GC-MS/MS

Ursprünglich von Shimadzu Corporation in Zusammenarbeit mit Restek Corporation veröffentlicht.

Einführung

In den USA werden Nahrungsergänzungsmittel in zunehmendem Maße verwendet. Diese Produkte werden aus diversen getrockneten Pflanzen hergestellt, die aufgrund landwirtschaftlicher Praktiken Pestizidrückstände enthalten können. Zur Sicherung ihrer Qualität und um eine Exposition zu vermeiden, ist ihre Überwachung deshalb unerlässlich. Die Inhaltsstoffe liegen in getrocknetem Zustand vor, so dass die Standard-QuEChERS-Methoden [1] modifiziert werden müssen. Die beste Methode zur Trennung von Mehrstoffgemischen mit koextrahierten Störsubstanzen ist die Gaschromatografie. In Verbindung mit einem hochempfindlichen Triple-Quadrupol-Massenspektrometer (GC-MS/MS) lassen sich so Verunreinigungen im Spurenbereich nachweisen. In dieser Studie haben wir auf einem Triple-Quadrupol GC-MS/MS-System mit der modifizierten QuEChERS-Methode mehr als 200 Verbindungen gleichzeitig analysiert. 

Materialien und Methoden

Pestizidstandards, interne Standards, Qualitätskontrollstandards und ein QuEChERS-Kit wurden von Restek erhalten:

• GC Multipestizid-Kit (Art.-Nr. 32562)
• QuEChERS Internal Standard Mix für die GC-MS Analyse (Art.-Nr. 33267)
• SV Internal Standard Mix (Art.-Nr.31206)
• Q-sep QuEChERS Extraktions-Kit (Ursprüngliche Art.-Nr. 23991 wurde abgekündigt; siehe Art.-Nr. 25848)

Insgesamt wurden 232 Verbindungen (220 Pestizide, 6 interne Standards und 6 Qualitäts-kontrollstandards) analysiert. Kommerziell erhältliches Ginseng wurde als Matrix verwendet. Damit wurden matrixangepasste Kalibrierstandards (1 bis 200 ng/mL) und angereicherte Proben (jeweils zwei mit 10 ng/g und 50 ng/g) hergestellt. Kalibrierkurven (gewichtet 1/C) wurden mithilfe des internen Standards PCB52 generiert. 

Eine MRM-Analysemethode wurde unter Verwendung der Smart Pesticides Database (Shimadzu) erstellt. Diese Datenbank enthält Retentionsindizes für alle registrierten Verbindungen und die Retentionszeiten lassen sich durch Analyse eines n-Alkan-Probengemischs vorhersagen (AART: Automatic Adjustment of Retention Time). Auf der Basis der erwarteten Retentionszeiten erzeugt Smart MRM ein optimales Zeitprogramm zur Datenerfassung (Abbildung 1). 

Extraktion und Reinigungsverfahren

• 1.0 ± 0.05 g gemahlenes Ginsengpulver in 50-mL-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen einwiegen.
• 10 mL Wasser von HPLC-Qualität zugeben und das Röhrchen auf einem Vortex-Mischer kräftig schütteln.
• 10 mL des ACN/IS-Extraktionslösemittels zugeben.
• Röhrchen 15 Minuten stehen lassen.
• 4 g wasserfreies MgSO4 und 1 g NaCl zugeben.
• Röhrchen auf einem mechanischen Schüttelapparat bei hoher Schüttelintensität 30 Minuten lang schütteln.
• Die 50-mL-Röhrchen bei 3000–4500 U/min 5 Minuten zentrifugieren.
• Die GCB/PSA (0.25 g/0.5 g) SPE-Säulen mit ca. 250 mg oben aufgebrachtem wasserfreiem Na2SO4 und dem 3-fachen Säulenvolumen Aceton konditionieren.
• Sammelgestell mit 15-mL-Einweg-Glaszentrifugenröhrchen auf einem SPE-Vakuumverteiler einsetzen.
• 1.25 mL des ACN-Extrakts zugeben.
• Mit 1 mL Aceton spülen.
• Mit 12 mL eines Aceton-Toluol-Gemischs (3:1 Vol./Vol.) eluieren.
• Das Elutionsmittel vorsichtig (50 °C) bis auf ca. 100 μL verdampfen.
• 500 μL Toluol zu den Leer-/angereicherten Proben, den Kalibrierstandardlösungen und den matrixangepassten Kalibrierstandards hinzufügen.
• 20 μL Qualitätskontrollstandards (12.5 μg/mL) und ca. 50 mg wasserfreies MgSO4 zu allen Proben hinzufügen.
• 5 Sekunden lang auf dem Vortex-Mischer schütteln.
• Röhrchen 5 Minuten bei 3000 g zentrifugieren.
• Toluolextrakt mithilfe einer Pasteur-Pipette an die ALS GC-Fläschchen überführen.

Ergebnis und Diskussion

Matrixangepasste Kalibrierung

Das Chromatogramm in Abbildung 2 zeigt einen matrixangepassten 10-ng/mL-Kalibrierstandard. Von den 232 Verbindungen konnten 230 innerhalb von ±0.1 Minuten der erwarteten Retentionszeit durch AART nachgewiesen werden. Die zwei verbleibenden Verbindungen, 1,4-Dichlorbenzol-d4 und Naphthalin-d8 aus den sechs Qualitätskontrollstandards, eluierten in weniger als 4 Minuten. Obwohl die Retentionszeiten verschoben waren, fielen sie innerhalb von ±0.2 Minuten der erwarteten Retentionszeiten.

Column	Rxi-5ms, 30 m, 0.25 mm ID, 0.25 µm (cat.# 13423)
	using Rxi guard column 5 m, 0.25 mm ID (cat.# 10029)
	with SilTite μ-Union connector kit (cat.# 23885)
Standard/Sample	GC Multiresidue pesticide kit (cat.# 32562)
Diluent:	Toluene
Conc.:	10 ng/mL
Injection
Inj. Vol.:	2 µL pulsed splitless
Liner:	Topaz 3.5 mm ID single taper inlet liner w/wool (cat.# 23336)
Inj. Temp.:	250 °C
Pulse Pressure:	36 psi (248.2kPa)
Pulse Time:	1.5 min
Oven
Oven Temp.:	90 °C (hold 1 min) to 130 °C at 30 °C/min to 330 °C at 10 °C/min (hold 2 min)
Carrier Gas	He, constant linear velocity
Linear Velocity:	55 cm/sec

Detector	Shimadzu GCMS TQ8040
Transfer Line Temp.:	290 °C
Analyzer Type:	Quadrupole
Source Temp.:	230 °C
Electron Energy:	70 eV
Ionization Mode:	EI
Instrument	Shimadzu GCMS-TQ8040
Notes	Matrix-matched calibration standards were prepared in ginseng. Calibration curves were generated by the internal standard method using PCB52 as the internal standard. An MRM analytical method was created using the Shimadzu pesticides database. Although the multiresidue pesticides kit mixes are formulated to ensure maximum long-term stability and reliability as packaged, stability may become an issue when a large number of compounds with different chemical functionalities are combined together into a single mix. This should be taken into consideration for quantitative analysis.
Acknowledgement	Chromatogram provided by Shimadzu. Publication 3655-11615-10ANS (C146-E334), First Edition, December 2016. Residual Pesticides Analysis of Botanical Ingredients Using Gas Chromatography Triple Quadrupole Mass Spectrometry. Riki Kitano, Tairo Ogura, Nicole Lock, Robert Clifford, Julie Kowalski, Jack Cochran, Dan Li

Download PDF

Die Kalibrierkurven wurden mithilfe von matrixangepassten Kalibrierstandards erstellt und die Rückrechnung und Linearität wurden anschließend ausgewertet.

Die Rückrechnung wurde durchgeführt, indem die Konzentration jedes Kalibrierpunkts berechnet wurde. Wenn die Konzentration den theoretischen Wert um ±20 % übertraf, wurde der Kalibrierpunkt unter Einbeziehung der beiden nächstliegenden Punkte interpoliert. Mehr als 93 % der Verbindungen mit einer Konzentration von 1 ng/mL lagen innerhalb von ±20 % der theoretischen Berechnungen und alle Verbindungen mit Konzentrationen von 20 bis 200 ng/mL lagen innerhalb von ±20 % (Abbildung 3).

Diese modifizierte QuEChERS-Methode umfasst Verdünnungsschritte, wobei die Proben um ein Viertel verdünnt werden. Zur Quantifizierung der 10-ng/g-Konzentration werden Kalibrierpunkte mit 2 ng/g oder weniger benötigt. Die Kalibrierkurven zeigen selbst bei niedrigen Konzentrationen gute Linearität (Abbildung 4) und alle Bestimmungskoeffizienten (220 Pestizide) waren größer als 0.99.

Wiederfindung angereicherter Proben

Es wurden jeweils zwei angereicherte Proben von 10 ng/g und 50 ng/g hergestellt (10 ng/g-1, 10 ng/g-2, 50 ng/g-1, 50 ng/g-2) und die Wiederfindungsraten wurden aus dem Durchschnitt von drei aufeinander folgenden Datenpunkten für jede Probe bestimmt.

85 % der Verbindungen zeigten gute Wiederfindung zwischen 70 und 120 % bei 10 ng/g-1 und 50 ng/g-2. Wie oben erwähnt wurden die angereicherten Proben auf 2.5 ng/mL und 12.5 ng/mL verdünnt. Da die Kalibrierkurven gute Linearität bei niedrigen Konzentrationen zeigten und die modifizierte QuEChERS-Methode Interferenzen unterdrückte, ließen sich gute Wiederfindungsergebnisse erzielen. (Einige Verbindungen ließen sich nicht korrekt quantifizieren, da sie in der Matrix für die Kalibrierstandards ursprünglich enthalten waren. Der y-Abschnitt lag höher und diese Verschiebung kann zu fehlerhafter Quantifizierung führen, besonders bei niedrigen Konzentrationen. Über die Methode mit Zugabe von Standard wurden 16 Pestizide mit mehr als 10 ng/g in der Matrix nachgewiesen.)

In dieser Studie wurden die Wiederfindungsraten erneut geprüft und mit der qualitativen Information des relativen Ionenverhältnisses kombiniert. Die Ionenverhältnisse zwischen dem Zielanalyt und der Referenz wurden mit dem des 100-ng/g-Standards verglichen und gemäß SANCO/12571/2013 [2] ausgewertet. Danach wird die Verwendung des relativen Verhältnisses mit einem Toleranzbereich von ±30 % als Kriterium empfohlen.

Tabelle I zeigt die Wiederfindung und das relative Ionenverhältnis für alle Verbindungen und Abbildung 5 zeigt das Kombinationsdiagramm der Wiederfindung und des relativen Ionenverhältnisses, das aus dieser Tabelle generiert wurde. 76 % der Verbindungen in der Spalte 10 ng/g-1 lagen innerhalb von ±30 % des relativen Ionenverhältnisses mit guter Wiederfindung zwischen 70 und 120 %. Für 50 ng/g-2 lagen 83 % der Verbindungen innerhalb von ±30 % des relativen Ionenverhältnisses. Verbindungen mit schlechter Wiederfindung bzw. mit mehr als ±30 % Abweichung vom relativen Ionenverhältnis wurden untersucht.

Tabelle I: Wiederfindung und relatives Ionenverhältnis; Relative Ionenverhältnisse wurden für 100-ng/mL-Standardlösungen berechnet.

Die Verbindungen außerhalb des roten Felds (Abbildung 5) wurden in vier Gruppen unterteilt.

Gruppe A zeigte nur geringe Wiederfindung; diese Gruppe bestand in erster Linie aus Verbindungen mit einem niedrigen Siedepunkt. Sie sind möglicherweise bei der Verdampfung verloren gegangen. Gruppe B zeigte hohe relative Ionenverhältnisse, verursacht durch Matrixinterferenzen. Gruppe C zeigte eine hohe Wiederfindung; diese Gruppe bestand aus angereicherten Proben von 10 ng/g. Einige dieser Verbindungen lagen ursprünglich in der Matrix vor und wurden falsch quantifiziert. Bei anderen wurden die hohen Werte durch ihre Übergänge verursacht, die niedrige Response und geringe Stabilität hatten. Gruppe D zeigte ein niedriges relatives Ionenverhältnis. Hier mussten Übergänge mit höherer Response festgelegt werden. Durch Änderung einiger Verfahren und Parameter lassen sich die Positionen dieser Verbindungen möglicherweise verbessern. 

Schlussfolgerung

Diese Studie zeigt, dass die modifizierte QuEChERS-Methode in Verbindung mit GC-MS/MS zur konsistenten Überwachung von Pestiziden in pflanzlichen Inhaltsstoffen geeignet ist.

Obwohl getrocknete Proben oft mit einer schweren und schwierigen Matrix verbunden sind, ließen sich mithilfe der modifizierten QuEChERS-Methode, einer SPE-Säulenreinigung und der Verdünnung mit Toluol matrixbedingte Interferenzen unterdrücken. Mittels GC-MS/MS ließen sich selbst bei verdünnten Proben äußerst kleine Pestizidmengen nachweisen. Die Analysemethode dauert insgesamt nur 30 Minuten und deckt mehr als 200 Pestizide ab. Für Laboratorien, die derartige Analysen durchführen, ist dies eine Lösung mit hohem Durchsatz.

Literatur

[1] M. Anastassiades, S. J. Lehotay, D. Štajnbaher, F. J. Schenck, Fast and Easy Multiresidue Method Employing Acetonitrile Extraction/Partitioning and “Dispersive Solid-Phase Extraction” for the Determination of Pesticide Residues in Produce, J. AOAC Int., 86 (2003) 412–431
[2] European Commission, Health & Consumer Protection Directorate-General, Guidance document on analytical quality control and validation procedures for pesticide residues analysis in food and feed, SANCO/12571/2013