水中の超短鎖および短鎖PFAS分析に適したLC-MS／MSメソッド

要約

ペルおよびポリフルオロアルキル化合物（PFAS）は環境中に広く存在しており、さまざまな水源、例えば地下水、海水、工業用水などに含まれる超短鎖のPFASに関して、その種類や量、またそれらがどの程度人体への接触（曝露）があるかをモニタリングすることがとても重要になってきています。しかし、炭素鎖長がC4未満の小さくて極性の高い化合物（超短鎖PFAS）は、逆相液体クロマトグラフィー（RPLC）に基づいた標準的なPFAS分析メソッドで分析するのが難しいというのが現状です。そこで本研究では飲料水および非飲料類中の超短鎖PFAS（C1～C4）を正確かつ信頼性高く定量可能なLC-MS/MS分析メソッドを開発しました。また、分析プロセスを簡略化し、サンプル前処理過程における汚染リスクを回避するため、直接注入ワークフローを採用しました。

はじめに

短鎖PFASが長鎖PFASの代替品として長らく使用されてきたのは、一般的にC4～C6化合物と呼ばれる短鎖PFASが、長鎖PFASと比べて生物蓄積性が低く、毒性も低いとみなされていたからです。その結果、短鎖PFAS も環境中における蓄積増加が認められる一方で、その後の研究によって明らかになったのは、環境水系（たとえば、雨、川、雪、地下水、排水）には、炭素鎖長がさらに短い「超」短鎖PFASが広く分布し、高いレベルで存在している、ということでした。超短鎖PFASとはC1～C3化合物であり、トリフルオロ酢酸（TFA）、ペルフルオロプロパン酸（PFPrA）、トリフルオロメタンスルホン酸（TFMS）、ペルフルオロエタンスルホン酸（PFEtS）、ペルフルオロプロパンスルホン酸（PFPrS）などがあります。

TFA以外の超短鎖PFASの潜在的な発生源や、それらがどのように環境に広がっていくのか、ということは明らかになっていません。なぜなら、超短鎖PFASだけをモニタリングする分析メソッドが限られているからです。例えば、以下に挙げる従来の分析メソッドにはそれぞれ克服しなければならない課題があります。
●　GC-MS：超短鎖PFASであるTFAの分析は可能ですが、誘導体化が必要です。また、C1～C4のペルフルオロアルキルカルボン酸（PFCA）とペルフルオロアルキルスルホン酸（PFSA）を同時に分析することはできません。
●　陰イオン交換LCカラムを使った分析：超短鎖および短鎖PFAS（C1-C4）の分析に使った場合、保持が非常に長いため、分析時間も長く（20分以上）なり、ピーク形状もブロードになります。成分の分離が悪く、正確な定量が困難になるうえに、コストも増加し、データの信頼性も低下する、という課題があります。
●　超臨界流体クロマトグラフィー（SFC）を使った分析：良好な分析結果を示しますが、高価な装置が必要です。
●　逆相液体クロマトグラフィー（RPLC）を使った分析：主にC4以上の短鎖PFASに適していますが、C4未満の超短鎖PFASの分析では保持が十分ではありません。例えば、短鎖PFAS（C4）であるペルフルオロブタン酸（PFBA）の分析では、保持が最も小さく、多くの場合その溶出のピーク形状はブロードで非対称となります。ピーク形状の悪さは検出感度や定量精度の低下を示しています。

そこで、PFAS分析において使用されているRPLCの課題を解決することにフォーカスし、Restekが以前開発した、飲料水と非飲料水に含まれるC2～C8の超短鎖、短鎖、および長鎖PFASを定量する分析メソッドをご紹介します［1］。この開発の過程で、ハイブリッドHILIC/イオン交換機能を持つRaptor Polar Xカラムが従来型（長鎖）PFAS、代替型（短鎖）PFAS、超短鎖PFASを同時に分析するのに適していることが分かりました。C2～C8の超短鎖、短鎖、および長鎖PFASに関してRaptor Polar Xカラムは、PFSAsがPFCAsよりも早く溶出する、つまり保持が短く分離が良好であるという分析結果を示しました。さらに、短鎖の化合物は長鎖の化合物よりも強く保持されました。この分析メソッドでは、移動相の水系溶媒として10mMギ酸アンモニウムおよび0.05%ギ酸を含む水溶液、および移動相の有機溶媒として0.05%ギ酸を含むアセトニトリル:メタノール（60：40）の混合溶液を採用しています。長鎖PFASの保持を長くするために、移動相の有機溶媒としてメタノールを加えることが必要でした。さらに、アセトニトリルとメタノールの混合比率を60：40にすることで、分析対象成分の保持および分離を制御してマトリックス干渉も軽減できました。ただ、移動相の有機溶媒としてメタノールを使用することで、MS感度は低下してしまいました。そこで、水中のPFAS分析用の、オリジナルのLC-MS/MS分析メソッドを再検討することになりました。優れた性能はそのままに検出感度を向上させることを目標にし、超短鎖および短鎖PFAS（C1-C4）のみにフォーカスした結果、この分析メソッドは、直線性、精度、および再現性の点で適用範囲が広いと評価されるに至りました。

実験

標準試料およびサンプルの前処理

【標準試料】
　◦　校正用標準溶液（0.4mL）を、濃度が2.5～800 ng/L（ppt）の範囲内になるように逆浸透（RO）水で希釈し、ポリプロピレン製HPLCバイアル内に調製
　◦　内部標準（IS）として同位体標識されたPFBAとペルフルオロブタンスルホン酸（PFBS）を使用
　◦　10 ng/mLの作業溶液からの4 µLの一定分量を標準試料に混合

【サンプル】
　◦　水道水とボトル入りの水はろ過せずそのまま使用
　◦　排水サンプルを（10mL以下）Norm-Jectシリンジ（10 mL ルアーロックチップ; 品番22775）とナイロン製シリンジフィルター（30 mm, 0.45 µm; 品番23981）でろ過し、50 mLポリプロピレンチューブに回収
　◦　精度と再現性を確認する実験では、1mLの水サンプルを25、50、175 pptの既知濃度になるような添加サンプルにし、一定分量（0.4 mL）をポリプロピレン製バイアルに移し、LC-MS/MS分析用に注入する前に4 µLのIS作業溶液と混合

水中のPFASのLC-MS/MS分析メソッド

水中のPFASのLC-MS/MS分析は、Xevo TQ-S トリプル四重極質量分析計を使用したWaters ACQUITY I-class UPLCシステムで行いました。イオン化モードとしてnegative ESIを使用して化合物をチューニングし、プレカーサイオンとプロダクトイオンを決定し、複数のプロダクトイオンの中で信号強度が最も高いプロダクトイオンをサンプル内のPFASの濃度を決定するための定量イオンとして、また、もう一つの二次プロダクトイオンを測定対象のPFASの確認（存在の特定やその種類や濃度を測定すること）するための確認用イオンとして使用することにしました。プロダクトイオンが1つしか同定できなかったTFA、PFPrA、PFBAについては確認用イオンがない、ということになります。各分析対象成分の保持時間とMSトランジションのパラメータについてはTable Iを参照してください。

HILIC/イオン交換Raptor Polar Xカラムでの超短鎖および短鎖PFAS（C1-C4）のこのイソクラティック分析では、PFASディレイカラムは必要ない、ということをご留意ください。ただし、グラジエント溶出RPLCメソッドでは、LCシステムからの長鎖PFASによるバックグラウンド汚染（装置やサンプルから検出される微量の汚染物質による汚染）を減らすためにPFASディレイカラムを使用します。

Table I: 分析対象成分のMSイオントランジション、パラメータ、および クロマトグラフィー保持時間

* 定量イオン/確認用イオン

結果と考察

超短鎖PFAS汚染に対する溶媒と器具の清浄度

超短鎖PFASはどこにでも存在します。超短鎖PFASによるバックグラウンド汚染を防ぐために、ラボにある試薬や器具の清浄度を徹底的に調べることは特に重要です。いくつかのブランドのLC/MSまたはHPLCグレードの水、アセトニトリル、イソプロパノール、メタノールを調べたところ、上記の溶媒すべてに微量またはそれ以上のTFAが含まれていることが分かりました。また、検出可能な量にばらつきはあったものの、PFPrAとPFBAも含まれていました。最終的に今回の実験で、移動相の前処理用に採用されたのは、TFA、PFPrA、PFBAの検出レベルが最も低い市販の溶媒でした。脱イオン水および逆浸透(RO)で精製された水（Restek製）についても、分析対象成分の汚染がないか、清浄度を調べました。RO水からはPFPrAとPFBAは検出されず、TFAは検出されましたがほんの僅かでした。この結果から、RO水は移動相、作業溶液、最終的な校正標準溶液、サンプル希釈液の前処理および調製に使用されました。

分析メソッドの開発

分析メソッド開発の過程で移動相の有機溶媒として100%アセトニトリルで試してみたところ、超短鎖PFASおよび短鎖PFAS（C1-C4）の検出には非常に効果的でした。その反面、すべての分析対象成分の保持が短くなってしまったので、サンプルの流速やギ酸の濃度を調整して保持を適切な長さにしました。TFAに関しては、少量のイソプロパノールとアセトニトリルを混合することでクロマトグラム上で安定したベースラインを得ることができました。最終的な分析メソッドでは、RO水に10 mMギ酸アンモニウムと0.1%ギ酸を加えた水系移動相（移動相A）と、アセトニトリル:イソプロパノール（95:5）に0.1%ギ酸を加えた有機移動相（移動相B）を用い、85%Bおよび流速0.3 mL/分でイソクラティック溶出を行いました。

マトリックス効果を補正する、つまりマトリックスが分析結果に与える影響を最小限にするために、2種類の同位体標識されたC4 PFAS標準試料、つまり、¹³C₃-PFBS (M3PFBS) および ¹³C₄-PFBA (M4PFBA)を内部標準として使用することが適切かどうかを調べました。PFCAおよびPFSA化合物クラスの内部標準として、それぞれM4PFBAおよびM3PFBSを導入することにより、定量精度が大幅に向上した、という結果でした。RO水で調製した標準試料を使った分析のサイクルタイムは5分間が適切でしたが、水道水、ボトル入りの水、排水の分析のサイクルタイムは、マトリックス抑制による分析精度の低下を避けるために、7分間必要でした。

Figure 1: 最終的なLC-MS/MSメソッド分析条件で分析した超短鎖および短鎖PFAS（C1-C4）標準試料（400 ng/L）のクロマトグラム（ピークリストと分析条件を含む完全版はPDFでダウンロード可）

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直線性

線形回帰(1/x重み付け)を用いると、すべての分析対象成分の直線性は許容範囲でした。C1～C4のPFAS化合物は2.5～800ppt、PFBAおよびPFPrAは5.0～800ppt、TFAは20～800pptの検量線範囲でr²値が0.995以上、偏差20%未満でした。

メソッドの精度と再現性

水道水、ボトル入りの湧水、公的機関が運営する排水処理施設（POTW）からの排水（処理済み排水）のサンプルを、全ての分析対象成分に対して25、50、175pptの既知濃度になるような添加サンプルにしました。3日間にわたり、3つのバッチを分析、つまり、各水サンプルの各添加サンプルに対し合計9回の分析を行いました。

水道水、ボトル入り水、POTW排水の三種類の水サンプルすべてに、量は異なりますがTFAが含まれていました。水道水のサンプルにはTFMSも含まれ、POTW排水のサンプルにはTFAやTFMSに加え、PFBSとPFPrAも含まれていました。上記のPFASの濃度を添加サンプルの計算された濃度から差し引き、回収率を計算しました。POTW排水内のTFA濃度が非常に高かったので、TFAに関する分析の精度と再現性を測定するための添加サンプルを作る前にPOTW排水をRO水で5倍に希釈しました。25pptの既知濃度になるような添加サンプルのTFAについては、TFA濃度が高く、その濃度を差し引いた正確な定量ができなかったため、データを収集しませんでした。平均回収率と相対標準偏差（RSD）のデータについては、Table IIをご参照下さい。すべての分析対象成分の回収率は86.6～107% （3つの添加サンプルと3種類の水サンプルについて）でした。RSD値が1.62～10.7%以内であることは、このメソッドの再現性が十分に高いことを証明しています。

飲料水および非飲料水内の超短鎖および短鎖PFAS（C1-C4）の測定

分析メソッドの検証をする実験の後で、この直接注入ワークフローを適用して、水道水、ボトル入り水、天然湧水、井戸水、排水を含むさまざまな源水中の超短鎖および短鎖PFAS（C1-C4）を測定しました。ブランクサンプルと添加サンプル（50ppt）をそれぞれn=3で調整し、分析した結果、添加サンプルの平均回収率はいずれも75～120％以内でした。したがって、このように確立された水中のPFAS分析用のLC-MS/MS分析メソッドは、飲料水および非飲料水源中の超短鎖および短鎖PFAS（C1-C4）を正確に測定するのに適している、と言えるでしょう。

分析の結果についてはTable IIIをご参照ください。水道水に関して、TFAは～120～500pptの範囲でRO精製されたものを除くすべてのサンプルに含まれ、TFMSはほとんどのサンプルに含まれており定量可能で、PFPrAはいくつかのサンプルで検出可能でした。ボトル入り水に関しても、TFAはRO精製されたものを除くすべてのサンプルに含まれていました。RO精製された水道水、ボトル入り水に関しては、検出可能なレベルで超短鎖および短鎖PFAS（C1-C4）は含まれていませんでした。井戸水のサンプルには、他のサンプルと比べるとTFMSの量が比較的多く含まれていました。POTW、病院、金属仕上げ業者、化学薬品メーカーからの処理済み排水サンプルのいずれもが、高濃度でTFAとPFPrAを含んでいました。特に化学薬品メーカーからの処理済み排水はTFA、PFPrA、PFBAの汚染が顕著に高い結果となりました。

結論

ここでご紹介したように、水中のPFAS分析用のLC-MS/MS分析メソッドが確立され、この分析メソッドは様々な水マトリックス内の超短鎖および短鎖PFASを定量するための唯一無二のソリューションとなりました。実験を通して、この分析メソッドが確固たるもので、精度高く、再現性のあるものであることが証明されています。さらに直接注入を使用し、7分間のサイクルタイムで分析を行うことで、分析を簡単かつ迅速に実施でき、今までより高いサンプルスループットを実現しています。最も強調したいのは、この分析メソッドが環境水システム中に新たに出現した超短鎖および短鎖PFAS（C1-C4）汚染をモニタリングするための効果的なツールを提供している、ということです。また、この分析メソッドは、将来的なPFAS規制措置に向けて、科学者や専門家がガイドラインを作成する際に役立つことでしょう。

参考文献

1. S.H. Liang, A novel approach for ultrashort-chain PFAS analysis in water samples: direct, simultaneous determination of ultrashort-chain, alternative, and legacy PFAS, Application note EVAN3220A-UNV, Restek Corporation, 2021. articles/a-novel-approach-for-ultrashort-chain-pfas-analysis-in-water-samples

Table II: 水の添加サンプルの分析メソッドの精度と再現性

Table III: さまざまな飲料水および非飲料水中のC1-C4 PFASの定量

nd = 検出されず