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Anatomia delle colonne LC per PFAS: scegli la fase, le dimensioni e il tipo di particelle migliori!

Se il tuo laboratorio è uno dei tanti che ogni giorno effettuano analisi di sostanze per- e polifluoroalchiliche (PFAS) nei campioni saprai bene che la consapevolezza e l’interesse in questo ambito sono sempre maggiori, così come la comprensione circa la diffusione, la persistenza e i potenziali rischi per la salute connessi a queste sostanze chimiche “eterne”. Con l’aumento dell’interesse cresce anche la necessità di metodi analitici veloci, accurati e precisi. Questo fattore è un traino per lo sviluppo di metodi migliori e le scelta della colonna LC rappresenta la base per arrivare a un approccio più adatto, particolarmente importante se si considera l'ampliamento dell’elenco dei PFAS monitorati, che comprendono composti a catena alchilica sempre più corta. In questo articolo analizzeremo le proprietà da tenere assolutamente in considerazione nella scelta di una colonna LC per le analisi dei PFAS.

Selezionare la fase e la dimensione della colonna

L’individuazione di una fase stazionaria efficace è il primo passo da compiere per capire quale colonna LC per PFAS utilizzare. Per questa scelta, è fondamentale sapere qual è la gamma di PFAS di interesse.

PFAS a catena corta e superiori

Quando si parla di analisi di PFAS a catena corta (C4-C6) e lunga, dal confronto che abbiamo effettuato tra le diverse fasi chimiche è emerso che la fase C18 presenta la migliore selettività. Quando la catena alchilica delle molecole di PFAS si allunga, aumentano le interazioni tra le catene e il ligando C18, generando un ottimo meccanismo di ritenzione e risoluzione. La ritenzione è sufficientemente forte da consentire l’utilizzo di una colonna relativamente breve e stretta per risolvere gli analiti target in modo veloce ed efficace. L'esempio nella Figura 1 mostra che una colonna Raptor C18 da 50 x 2,1 mm eluisce e separa facilmente i composti di interesse rispettando tutti i criteri del metodo EPA 537.1 per l’analisi dell’acqua potabile in meno di 8 minuti (tempo di analisi totale: 10 minuti).

cgarm-img — **Figura 1:** La colonna Raptor C18 da 50 x 2,1 mm è una scelta straordinaria: rispetta tutti i criteri del metodo 537.1 in un ciclo rapido con tempo totale di soli 10 minuti.

	Peaks	t_R (min)	Conc. (ng/L)	Precursor Ion	Product Ion
1.	Perfluorobutanesulfonic acid (PFBS)	2.06	10	298.8	79.9
2.	Perfluoro-n-[1,2-¹³C₂]hexanoic acid (¹³C₂-PFHxA)	3.03	5	314.9	270.0
3.	Perfluorohexanoic acid (PFHxA)	3.04	5	312.9	268.7
4.	Tetrafluoro-2-heptafluoropropoxy-¹³C₃-propanoic acid (¹³C₃-HFPO-DA)	3.36	5	286.8	168.7
5.	Hexafluoropropylene oxide dimer acid (HFPO-DA)	3.38	5	285.0	168.9
6.	Perfluoroheptanoic acid (PFHpA)	4.09	5	362.8	318.8
7.	Perfluorohexanesulfonic acid (PFHxS)	4.22	10	398.8	79.9
8.	4,8-Dioxa-3H-perfluorononanoic acid (ADONA)	4.24	5	376.9	250.7
9.	Perfluoro-[1,2-¹³C₂]octanoic acid (¹³C₂-PFOA)	4.88	5	415.0	370.0
10.	Perfluorooctanoic acid (PFOA)	4.90	5	413.1	368.9
11.	Perfluorononanoic acid (PFNA)	5.54	5	462.9	418.9
12.	Perfluoro-1-[1,2,3,4-¹³C₄]octanesulfonic acid (¹³C₄-PFOS)	5.57	10	503.0	80.0

	Peaks	t_R (min)	Conc. (ng/L)	Precursor Ion	Product Ion
13.	Perfluorooctanesulfonic acid (PFOS)	5.58	10	498.9	80.0
14.	9-Chlorohexadecafluoro-3-oxanone-1-sulfonic acid (9Cl-PF3ONS)	5.88	5	530.8	350.7
15.	Perfluoro-n-[1,2-¹³C₂]decanoic acid (¹³C₂-PFDA)	6.08	5	514.9	469.9
16.	Perfluorodecanoic acid (PFDA)	6.08	5	512.9	469.0
17.	N-deuteriomethylperfluoro-1-octanesulfonamidoacetic acid (d3-NMeFOSAA)	6.28	10	572.9	418.8
18.	N-methyl perfluorooctanesulfonamidoacetic acid (NMeFOSAA)	6.30	10	569.8	418.8
19.	N-deuterioethylperfluoro-1-octanesulfonamidoacetic acid (d5-NEtFOSAA)	6.51	10	588.9	418.8
20.	N-ethyl perfluorooctanesulfonamidoacetic acid (NEtFOSAA)	6.52	10	583.8	418.8
21.	Perfluoroundecanoic acid (PFUnA)	6.55	5	562.9	518.8
22.	11-chloroeicosafluoro-3-oxaundecane-1-sulfonic acid (11Cl-PF3OUdS)	6.77	5	630.7	451.0
23.	Perfluorododecanoic acid (PFDoA)	6.95	5	612.7	568.9
24.	Perfluorotridecanoic acid (PFTrDA)	7.30	5	662.7	618.8
25.	Perfluorotetradecanoic acid (PFTA)	7.60	5	712.7	668.7

Detector	MS/MS
Ion Mode:	ESI-
Mode:	MRM
Instrument	HPLC

PFAS a catena ultra-corta

Con la messa al bando dei PFAS C8 è iniziata la commercializzazione di altri composti a catena alchilica più corta, e dal momento che i PFAS di interesse sono di più, i composti con catena da meno di quattro atomi di carbonio, o “ultra-corta” (C2 e C3), stanno riscuotendo un’attenzione sempre maggiore. Una catena di carbonio più corta aumenta l’influenza della testa polare, riducendo così la ritenzione di una colonna C18 che presenta un meccanismo di ritenzione basato principalmente sull'interazione idrofobica.Per i composti PFAS C3 come l'acido perfluoropropionico (PFPrA) e l’acido perfluoropropansolfonico (PFPrS), scegliendo una colonna di dimensioni adeguate una fase C18 sarà comunque efficace. Nella Figura 2, per esempio, una colonna Raptor C18 da 100 x 3 mm mostra prestazioni eccezionali, incorporando facilmente PFAS C3 in un’analisi rapida di 11 minuti.

	Peaks	t_R (min)	Conc. (ng/L)	Precursor Ion	Product Ion
1.	Perfluoropropanoic acid (PFPrA)	2.74	80	162.9	119.0
2.	Perfluorobutanoic acid (PFBA)	4.69	80	212.8	169.0
3.	Perfluoropropanesulfonic acid (PFPrS)	5.13	80	248.8	79.6
4.	Perfluorobutanesulfonic acid (PFBS)	6.14	80	298.8	79.9
5.	Perfluoro-n-[1,2-¹³C₂]hexanoic acid (¹³C₂-PFHxA)	6.75	50	314.9	270.0
6.	Hexafluoropropylene oxide-dimer acid (HFPO-DA)	6.92	80	285.0	168.9

	Peaks	t_R (min)	Conc. (ng/L)	Precursor Ion	Product Ion
7.	Ammonium 4,8-dioxa-3H-perfluorononanoate (ADONA)	7.33	80	376.9	250.7
8.	Perfluorooctanoic acid (PFOA)	7.70	80	413.1	368.9
9.	Perfluoro-[1,2-¹³C₂]octanoic acid (¹³C₂-PFOA)	7.70	50	415.0	370.0
10.	Perfluorooctanesulfonic acid (PFOS)	8.01	80	498.8	80.0
11.	Perfluoro-[1,2,3,4-¹³C₄]octanesulfonic acid (¹³C₄-PFOS)	8.01	50	503.0	80.0
12.	9-Chlorohexadecafluoro-3-oxanonane-1-sulfonate (9Cl-PF3ONS)	8.15	80	530.8	350.7
13.	11-Chloroeicosafluoro-3-oxanonane-1-sulfonate (11Cl-PF3OUdS)	8.61	80	630.7	451.0

Detector	MS/MS
Ion Mode:	ESI-
Mode:	MRM
Instrument	UHPLC
Sample Preparation	In a polypropylene vial, 250 µL of reagent water (fortified at 80 ppt) was mixed with 250 µL of 40:60 reagent water:methanol and 5 µL of internal standard solution (5 ng/mL of ¹³C₂-PFHxA, ¹³C₂-PFOA, ¹³C₄-PFOS in methanol). The vial was capped with a polyethylene cap prior to analysis.
Notes	A PFAS delay column (cat.# 27854) was installed between the pump mixer and the injector.

Se nell’ elenco dei composti monitorati compaiono dei PFAS C2 (per esempio, l’acido trifluoroacetico) è necessaria una chimica di fase diversa, che abbia come target il gruppo polare di una molecola PFAS. Il passaggio da una colonna C18 caratterizzata principalmente da interazioni idrofobiche a una Raptor Polar X, contraddistinta da una fase stazionaria che consente sia la modalità di ritenzione HILIC che quella a scambio ionico, permette la ritenzione di PFAS a catena ultra-corta. Oltre ai PFAS a catena ultra-corta, la colonna Raptor Polar X è in grado di trattenere e separare anche composti PFAS a catena corta, tradizionali e alternativi nella stessa analisi, offrendo così il metodo più completo per l’ analisi singola dei PFAS, come illustrato nella Figura 3.

	Peaks	t_R (min)	Conc. (ng/L)	Precursor Ion	Product Ion
1.	11-Chloroeicosafluoro-3-oxanonane-1-sulfonate (11CL-PF3OUdS)	1.25	400	630.78	450.80
2.	9-Chlorohexadecafluoro-3-oxanonane-1-sulfonate (9Cl-PF3ONS)	1.34	400	530.78	350.85
3.	Perfluorooctanesulfonic acid (PFOS)	1.38	400	498.84	79.97
4.	Perfluorohexanesulfonic acid (PFHxS)	1.49	400	398.90	79.97
5.	Perfluorobutanesulfonic acid (PFBS)	1.64	400	298.97	79.97
6.	Perfluoropropanesulfonic acid (PFPrS)	1.73	400	248.97	79.98
7.	Perfluoroethanesulfonic acid (PFEtS)	1.86	400	198.98	79.92

	Peaks	t_R (min)	Conc. (ng/L)	Precursor Ion	Product Ion
8.	Hexafluoropropylene oxide dimer acid (HFPO-DA)	2.06	400	284.97	168.92
9.	Perfluorooctanoic acid (PFOA)	2.11	400	412.90	368.91
10.	Ammonium 4,8-dioxa-3H-perfluorononanoate (ADONA)	2.15	400	376.90	250.93
11.	Perfluorohexanoic acid (PFHxA)	2.36	400	312.97	268.90
12.	Perfluorobutanoic acid (PFBA)	2.76	400	212.97	168.97
13.	Perfluoropropionic acid (PFPrA)	3.06	400	163.03	119.01
14.	Trifluoroacetic acid (TFA)	3.77	400	113.03	69.01

Detector	MS/MS
Ion Mode:	ESI-
Mode:	MRM
Instrument	UHPLC

Selezionare il tipo e la dimensione delle particelle della colonna

Oltre alla chimica della fase e alle dimensioni della colonna, occorre fare delle scelte anche circa la dimensione e il tipo di particelle. In sostanza, la scelta più versatile è quella che ricade su particelle superficialmente porose (SPP) da 2,7 µm, come quelle presenti nelle colonne Raptor. Le colonne LC per PFAS realizzate con queste particelle permettono una cromatografia efficiente tanto quanto le colonne con particelle totalmente porose (FPP) da meno di 2 µm, ma senza la pressione ultra-elevata che le caratterizza e che consente al laboratorio di utilizzare strumenti UHPLC o HPLC e ottenere analisi rapide e affidabili.

Tuttavia, la scelta della dimensione e del tipo di particelle avrà un effetto maggiore o minore a seconda della configurazione dello strumento. Per esempio, i laboratori che utilizzano strumenti HPLC tradizionali e impiegano regolarmente colonne FPP da 5 µm probabilmente noteranno un miglioramento sorprendente con il passaggio a una colonna SPP, a prescindere dalla dimensione delle particelle. Le colonne SPP permettono si ottenere facilmente una maggiore efficienza cromatografica e migliori forme del picco pur operando sempre nella regione di pressione della maggior parte degli strumenti HPLC. Corse più rapide con gli stessi strumenti: niente di meglio per i tanti laboratori che puntano ad aumentare la produttività dei campioni senza dover sostenere i costi ingenti di uno strumento UHPLC.

Per i laboratori che già utilizzano strumenti UHPLC, la dimensione delle particelle, soprattutto per le colonne impaccate SPP, non fa molta differenza in termini di efficienza e velocità di analisi. La Figura 4 illustra l’effetto della dimensione delle particelle utilizzando tre colonne SPP Raptor e una serie di PFAS su un sistema UHPLC. Sebbene i picchi più stretti siano quelli ottenuti sulla colonna con particelle da 1,8 µm, come previsto dai principi cromatografici generali, non si osserva uno scostamento significativo tra l’efficienza della colonna da 5 e 1,8 µm. È invece di rilievo la differenza a livello di contropressione generata nell’ottenere questi risultati molto simili, utilizzando per le colonne con particelle da 5 e 2,7 µm delle pressioni che rientrano nel range degli strumenti HPLC tradizionali. Con una colonna LC per PFAS impaccata con queste particelle è possibile ottenere le prestazioni tipiche dell’UHPLC senza la pressione che caratterizza questo sistema.

Una colonna LC per PFAS con particelle SPP è l’asso nella manica per massimizzare l’efficienza, che spesso si traduce in tempi di analisi rapidi, pur mantenendo più bassa possibile la contropressione degli strumenti. Tuttavia, molti laboratori che da tempo utilizzano le colonne FPP potrebbero essere restii ad abbandonarle. La buona notizia è che una FPP può essere utilizzata anche per analizzare con successo i PFAS. L’area superficiale e la carica di carbonio più elevate, tipiche di una colonna FPP come la Force C18, consentono una maggiore ritenzione cromatografica rispetto a una colonna SPP (Raptor C18) con particelle di dimensioni simili (Figura 5)

Conclusioni

Nella scelta di una colonna LC per PFAS, una SPP Raptor da 2,7 µm offrirà una ritenzione eccellente, tempi di analisi ridotti e compatibilità con gli strumenti UHPLC e HPLC. La scelta della fase stazionaria dipende dalla gamma di PFAS oggetto di monitoraggio, e una colonna Raptor C18 è un’alternativa eccellente per i PFAS con lunghezza di catena fino a C3. Tuttavia, una colonna Raptor Polar X rappresenta la scelta più indicata per ottenere l’analisi singola più completa dei PFAS, che comprende quelli a catena ultra-corta (C2-C3) e superiori, come pure i PFAS alternativi.

Ricordiamo che per un’analisi in tracce con una colonna Raptor C18 è possibile ridurre i falsi positivi o risposte elevate aggiungendo una PFAS delay column. L’impiego di una PFAS delay column consentirà di eliminare contaminanti PFAS di fondo connessi agli strumenti, che possono coeluire con gli analiti campione.

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