Effet du Solvant Organique sur la Sélectivité dans les Séparations LC
Des solvants organiques différents produiront des résultats chromatographiques différents, et la base de bonnes séparations repose sur les choix de la phase mobile et de la chimie de phase stationnaire afin de créer plusieurs degrés d’interaction entre eux et les analytes d’intérêt. Dans ce travail, nous allons expliquer comment les différences dans les modificateurs organiques ont pour conséquence les performances chromatographiques que vous observez lorsque vous utilisez de l’acétonitrile ou du méthanol avec des colonnes LC de phase inverse. Plus précisément, nous allons nous intéresser à une phase stationnaire classique de type C18 ainsi qu’à une autre phase stationnaire de phase inverse très populaire elle-aussi, le type Biphenyl. Commençons par la C18.
L’une des premières différences à propos des modificateurs organiques que l’on apprend souvent est la « force d’élution », quelque fois représentée comme une « série éluotrope ». Cette série est simplement une liste de solvants, rangée par ordre de force d’élution, dans laquelle un solvant avec une force d’élution élevée est un solvant pour lequel les solutés ont une affinité forte par rapport à la phase stationnaire. La conséquence de cette forte affinité est que les analytes restent davantage dans la phase mobile, ce qui réduit les interactions avec la phase stationnaire et entraîne donc moins de rétention. Les analytes ont généralement une affinité plus faible pour les modificateurs organiques avec des forces d’élution plus faibles, et dans ce cas, ils auront plus d’interactions avec la phase stationnaire et donc une rétention plus importante, toutes choses étant égales par ailleurs.
En chromatographie de phase inverse, l’acétonitrile a une force d’élution plus importante que le méthanol. Par conséquent, nous nous attendrions, comme nous le voyons sur la Figure 1, qu’à un même pourcentage de modificateur organique dans la phase mobile, les analytes aient moins de rétention avec l’acétonitrile qu’avec le méthanol.
Mais quelque fois, on peut être intéressé de changer son modificateur organique tout en essayant d’obtenir la même séparation dans à peu près le même temps. Et la question est donc de savoir si cela peut être fait facilement.
Pour tenir compte des différences de force d’élution entre le méthanol et l’acétonitrile, vous devez changer la quantité de modificateur organique pour faire correspondre les temps de rétention. Lors d’un passage de l’acétonitrile au méthanol, vous devrez augmenter la force d’élution globale de la phase mobile en augmentant le pourcentage de méthanol. Il existe des tableaux (voir la Figure 4 de la référence [1]) qui, par exemple, peuvent donner des estimations du pourcentage de méthanol correspondant à la force d’élution d’un pourcentage donné d’acétonitrile. A l’aide de ces tableaux, nous avons pu déterminer une composition en méthanol dans la phase mobile qui correspondait assez bien à la force d’élution et aux performances chromatographiques des conditions en acétonitrile d’origine (Figure 1).
Figure 1 : Comparaison des temps de rétention de divers analytes (a) en utilisant de l’acétonitrile comme modificateur organique, (b) en utilisant du méthanol à la même composition dans la phase mobile, et (c) en utilisant un pourcentage de méthanol déterminé empiriquement pour correspondre à la force d’élution de l’analyse en acétonitrile. Colonne : Raptor ARC-18 (2.1 x 50 mm, 2.7µm) ; Pics : 1. uracile, 2. toluène, 3. naphthalène, 4. biphényl.
Ainsi, dans cet exemple, si vous souhaitez passer de l’acétonitrile au méthanol (ou vice-versa), vous pouvez déterminer la composition en modificateur organique qui correspondra à la force d’élution de la méthode que vous essayez de convertir. Mais il y a des fois où cette approche ne s’avère pas si simple. La méthode suivante, sur l’analyse de cannabinoïdes, montre que l’effet du solvant organique sur la sélectivité en LC n’est pas toujours simple à prévoir.
Partons sur une méthode dans l’acétonitrile que nous souhaitons passer en méthanol. Si nous faisons la même expérience que dans l’exemple ci-dessus, où nous avons simplement changé le modificateur organique tout en gardant le même pourcentage dans la phase mobile, nous voyons que la correspondance des forces d’élution, seule, pourrait ne pas fonctionner (Figure 2).
Comme prévu, la première chose que l’on remarque est que l’analyse est plus longue (beaucoup plus longue dans ce cas) avec du méthanol. Le méthanol est un solvant à plus faible force d’élution, on s’attend donc à ce que les composés éluent plus tard. Mais, si l’on regarde attentivement, on remarque dans cet exemple que plusieurs composés se déplacent considérablement par rapport aux composés voisins et même, dans certains cas, ils changent d’ordre d’élution ! Donc nous n’avons pas seulement un changement dans l’aspect rétentif de la chromatographie (force d’élution élevée, moins de rétention ; force d’élution plus faible, plus de rétention), nous avons également un changement de sélectivité (comment les composés éluent/sont séparés les uns par rapport aux autres).
Dans ce cas, les exemples les plus marquants sont des cas où les composés acides (par exemple CBDVA, CBDA, THCVA et CBNA) montrent une plus grande rétention que leurs homologues neutres (CBDV, CBD, THCV et CBN) lorsque le méthanol est utilisé comme modificateur organique en comparaison à l’acétonitrile. Encore une fois, on s’attend à ce que tous les composés aient plus de rétention, car le méthanol est le modificateur organique ayant la force d’élution la plus faible des deux, mais certains composés montrent une rétention encore plus élevée que leurs voisins lorsque le méthanol est utilisé par rapport à l’acétonitrile au même pourcentage de composition.
Figure 2 : Comparaison de l’effet du solvant organique sur la sélectivité en LC, avec un pourcentage de composition gardé constant, pour l’analyse de cannabinoïdes couramment contrôlés.
| Peaks | Conc. (µg/mL) | Acetonitrile tR (min) | Methanol tR (min) | |
|---|---|---|---|---|
| 1. | Cannabidivarinic acid (CBDVA) | 50 | 1.877 | 3.117 |
| 2. | Cannabidivarin (CBDV) | 50 | 2.086 | 2.563 |
| 3. | Cannabidiolic acid (CBDA) | 50 | 2.592 | 5.003 |
| 4. | Cannabigerolic acid (CBGA) | 50 | 2.750 | 6.678 |
| 5. | Cannabigerol (CBG) | 50 | 2.912 | 4.373 |
| 6. | Cannabidiol (CBD) | 50 | 3.084 | 4.233 |
| 7. | Tetrahydrocannabivarin (THCV) | 50 | 3.391 | 4.904 |
| 8. | Tetrahydrocannabivarinic acid (THCVA) | 50 | 4.279 | 11.237 |
| Peaks | Conc. (µg/mL) | Acetonitrile tR (min) | Methanol tR (min) | |
|---|---|---|---|---|
| 9. | Cannabinol (CBN) | 50 | 4.609 | 7.643 |
| 10. | Cannabinolic acid (CBNA) | 50 | 5.437 | 17.535 |
| 11. | Δ9-Tetrahydrocannabinol (Δ9-THC) | 50 | 5.815 | 9.866 |
| 12. | Δ8-Tetrahydrocannabinol (Δ8-THC) | 50 | 6.002 | 10.747 |
| 13. | Cannabicyclol (CBL) | 50 | 6.916 | 10.865 |
| 14. | Cannabichromene (CBC) | 50 | 7.263 | 14.387 |
| 15. | δ-9-Tetrahydrocannabinolic acid-A (THCA-A) | 50 | 7.612 | 23.975 |
| 16. | Cannabichromenic acid (CBCA) | 50 | 8.510 | 28.943 |
| Column | Raptor ARC-18 (cat.# 9314A65) |
|---|---|
| Dimensions: | 150 mm x 4.6 mm ID |
| Particle Size: | 2.7 µm |
| Pore Size: | 90 Å |
| Temp.: | 30 °C |
| Standard/Sample | |
| Inj. Vol.: | 5 µL |
| Mobile Phase | |
| Flow: | 1.5 mL/min |
| Detector | UV/Vis @ 228 nm |
|---|---|
| Instrument | Waters ACQUITY UPLC H-Class |
| Notes | Mobile Phase Details Acetonitrile (top) A: Water, 5 mM ammonium formate, 0.1% formic acid B: Acetonitrile, 0.1% formic acid 9 min isocratic run (75%B) Methanol (bottom) A: Water, 5 mM ammonium formate, 0.1% formic acid B: Methanol, 0.1% formic acid 30 min isocratic run (75%B) |
Ensuite, nous allons essayer de faire correspondre les forces d’élution et voir ce qu’il se passe. La Figure 3 montre les résultats de cette expérience (notez que la concentration du tampon de formiate d’ammonium est différente dans les deux conditions, mais elle a été modifiée pour garder constante la quantité totale chargée sur la colonne, comme c’est le cas sur la Figure 2). Nous pouvons voir que dans quelques cas, le CBN en étant un bon exemple, nous obtenons une assez bonne correspondance en terme de rétention des analytes lorsque nous faisons correspondre la force d’élution, mais le changement de sélectivité observé en Figure 2 est toujours présent. La nature de l’analyte lui-même aura beaucoup d’impact sur l’efficacité d’une telle approche (correspondance des forces d’élution) lorsqu’il s’agira d’essayer d’obtenir des résultats similaires avec des modificateurs organiques différents.
Figure 3 : Comparaison de l’effet de différents modificateurs organiques, à la même force d’élution (via une concentration plus élevée), sur la sélectivité de l’analyse des cannabinoïdes.
| Peaks | Conc. (µg/mL) | Acetonitrile tR (min) | Methanol tR (min) | |
|---|---|---|---|---|
| 1. | Cannabidivarinic acid (CBDVA) | 50 | 1.877 | 1.998 |
| 2. | Cannabidivarin (CBDV) | 50 | 2.086 | 1.700 |
| 3. | Cannabidiolic acid (CBDA) | 50 | 2.592 | 2.803 |
| 4. | Cannabigerolic acid (CBGA) | 50 | 2.750 | 3.479 |
| 5. | Cannabigerol (CBG) | 50 | 2.912 | 2.522 |
| 6. | Cannabidiol (CBD) | 50 | 3.084 | 2.522 |
| 7. | Tetrahydrocannabivarin (THCV) | 50 | 3.391 | 3.030 |
| 8. | Tetrahydrocannabivarinic acid (THCVA) | 50 | 4.279 | 5.876 |
| Peaks | Conc. (µg/mL) | Acetonitrile tR (min) | Methanol tR (min) | |
|---|---|---|---|---|
| 9. | Cannabinol (CBN) | 50 | 4.609 | 4.137 |
| 10. | Cannabinolic acid (CBNA) | 50 | 5.437 | 8.158 |
| 11. | Δ9-Tetrahydrocannabinol (Δ9-THC) | 50 | 5.815 | 5.170 |
| 12. | Δ8-Tetrahydrocannabinol (Δ8-THC) | 50 | 6.002 | 5.605 |
| 13. | Cannabicyclol (CBL) | 50 | 6.916 | 5.605 |
| 14. | Cannabichromene (CBC) | 50 | 7.263 | 6.828 |
| 15. | δ-9-Tetrahydrocannabinolic acid-A (THCA-A) | 50 | 7.612 | 10.969 |
| 16. | Cannabichromenic acid (CBCA) | 50 | 8.510 | 12.399 |
| Column | Raptor ARC-18 (cat.# 9314A65) |
|---|---|
| Dimensions: | 150 mm x 4.6 mm ID |
| Particle Size: | 2.7 µm |
| Pore Size: | 90 Å |
| Temp.: | 30 °C |
| Standard/Sample | |
| Diluent: | Methanol |
| Inj. Vol.: | 5 µL |
| Mobile Phase | |
| Flow: | 1.5 mL/min |
| Detector | UV/Vis @ 228 nm |
|---|---|
| Instrument | Waters ACQUITY UPLC H-Class |
| Notes | Mobile Phase Details Acetonitrile (top) A: Water, 5 mM ammonium formate, 0.1% formic acid B: Acetonitrile, 0.1% formic acid 9 min isocratic run (75%B) Methanol (bottom) A: Water, 7.14 mM ammonium formate, 0.1% formic acid B: Methanol, 0.1% formic acid 13 min isocratic run (82.5%B) |
Dans le cas de nos cannabinoïdes, bon nombre des composés dont la rétention relative change le plus sont de nature acide. Et c’est ce que vous pourriez observer si vous essayez cela vous-même. Certains composés sont plus affectés que d’autres, suffisamment pour modifier la sélectivité de la chromatographie. Dans un cas tel que celui-ci, il est possible que la cause soit l’existence d’un mécanisme d’interaction supplémentaire entre le modificateur organique et l’analyte lui-même, basé sur la chimie de l’analyte.
Dans notre premier exemple, nous n’avons eu aucune interaction sélective entre certains analytes et le modificateur organique donc nous avons pu faire correspondre les forces d’élution et ajuster la rétention en conséquence. Ce ne sera pas le cas lorsqu’il existe des caractéristiques de rétention spécifiques à certains composés, comme nous l’avons vu dans l’exemple sur les cannabinoïdes. Dans ces circonstances, vous ne pouvez pas simplement faire correspondre la force d’élution et vous attendre à obtenir des résultats chromatographiques similaires.
Il est vrai que l’effet du solvant organique sur la sélectivité peut ne pas compromettre les performances si vous avez une identification correcte des pics, mais dans notre exemple le changement de sélectivité a causé des coélutions qui ne sont pas acceptables pour cette analyse LC-UV.
Mais tout cela est-il vrai pour d’autres chimies de colonnes de phase inverse ? Jusqu’à présent, nous n’avons utilisé qu’une colonne C18, mais qu’en est-il pour une autre phase stationnaire de phase inverse très populaire comme la biphenyl ? Pour aller plus loin, examinons le premier exemple présenté sur la colonne C18, l’analyse de l’uracile, du toluène, du naphtalène et du biphenyl (Figure 1). Cette fois, nous recréerons à la place les conditions sur la phase stationnaire Biphényl.
Figure 4 : Comparaison de l’effet du solvant organique sur la sélectivité en LC, sur deux phases stationnaires de phase inverse différentes, en utilisant un pourcentage de modificateur organique correspondant. Toutes choses étant égales par ailleurs, notez comment le dernier composé, le biphenyl, se déplace lors de l’utilisation d’acétonitrile par rapport au méth-anol. Colonnes : Raptor ARC-18 (2.1 x 50 mm, 2.7µm), Raptor Biphenyl (2.1 x 50 mm, 2.7µm); Pics : 1. uracile, 2. toluène, 3. naphtalène, 4. biphényl.
Sur la Figure 4, nous voyons comme prévu une augmentation globale du temps de rétention pour tous les composés hydrophobes (toluène, naphtalène et biphenyl) lorsque l’on utilise du méthanol en comparaison à l’acétonitrile (le premier pic à éluer est l’uracile, qui est hydrophile et est utilisé comme marqueur de volume mort dans cette analyse en phase inverse). Ce qui n’est pas immédiatement apparent par contre, ce sont les subtiles différences de temps de rétention causés par les différents solvants en comparaison aux données de la C18. Prenons par exemple le dernier pic à éluer dans cet exemple, qui est le composé biphenyl (pas la phase stationnaire Biphenyl, mais l’analyte). Lorsque l’on utilise une phase mobile avec 55% d’acétonitrile sur la colonne C18, le pic du biphenyl élue à 1.7 minute, mais sur la colonne Biphenyl avec la même phase mobile avec 55% d’acétonitrile, le même pic élue à 1.176 minute. Il y a donc moins de rétention sur la colonne Biphenyl lorsque l’on utilise de l’acétonitrile. Si vous comparez les données en utilisant le méthanol comme modificateur organique à 55%, vous voyez que sur la colonne C18 le pic du biphenyl élue à 5.995 minute, par rapport à un temps de rétention de 7.44 minute sur la colonne Biphenyl. Donc dans ce cas, il y a plus de rétention sur la colonne Biphenyl lorsque l’on utilise du méthanol, mais pourquoi donc ?
La différence que nous observons en terme de rétention et de sélectivité entre les phases C18 et Biphenyl lors du changement de modificateur organique dans la phase mobile est liée aux différents mécanismes de rétention des phases stationnaires elles-mêmes. La phase stationnaire Biphenyl propose une sélectivité différente d’une phase C18 car ses cycles aromatiques phényles peuvent générer des interactions pi-pi avec les analytes d’intérêt. La polarisabilité de la phase Biphenyl lui permet de modifier sa distribution électronique en présence d’un analyte et d’induire une interaction dipolaire. Ces interactions sont le plus souvent observées avec des composés dipolaires, insaturés ou conjugués. La sélectivité unique de la phase Biphenyl est donc modifiée différemment que celle de la phase C18 par le choix du modificateur organique.
Structurellement, l’acétonitrile a un atome de carbone central qui a une triple liaison avec un atome d’azote. La triple liaison est également capable de contribuer ou d’interférer avec les interactions pi-pi. Ainsi, concernant le temps de rétention du pic de biphenyl avec l’acétonitrile comme modificateur organique, cela se traduit par une rétention plus faible sur la colonne Biphenyl que sur la C18. Cependant, lorsque vous passez au méthanol, un solvant organique qui n’a pas de liaisons pi, les interactions pi-pi entre la phase stationnaire et les analytes sont plus nombreuses, entraînant une sélectivité différente et une augmentation de la rétention sur la colonne Biphenyl en comparaison à la C18 pour l’analyte biphenyl, et dans une moindre mesure pour le naphtalène. L’acétonitrile a la capacité de générer une interaction supplémentaire avec la phase stationnaire qui n’est pas présente avec le méthanol, et cette interaction additionnelle peut fondamentalement modifier la façon dont les analytes interagissent avec la phase, augmentant la force d’élution de l’acétonitrile encore au-delà de ce que l’expérience avec la C18 prédirait.
En quoi cela change-t-il notre capacité à faire correspondre les forces d’élution et obtenir une chromatographie comparable ? Dans la Figure 5, nous avons d’abord évalué les mêmes conditions qui avaient donné une bonne correspondance avec la C18 (Figure 2). Comme l’on pouvait s’y attendre, lorsque l’on essaie d’obtenir les mêmes performances sur la colonne Biphenyl en utilisant les mêmes conditions de phase mobile à « force d’élution adaptée », nous avons toujours plus de rétention lorsque l’on utilise du méthanol. De par un fort degré d’interaction entre la phase stationnaire Biphenyl et le modificateur organique, la force d’élution effective de l’acétonitrile est donc plus importante sur la colonne Biphenyl que sur la colonne C18. Pour tenir compte de la différence de force d’élution effective, nous avons augmenté la composition en méthanol au-delà de ce qui est théoriquement considéré comme le pourcentage correspondant aux conditions d’origine en acétonitrile, et nous avons obtenu des résultats très similaires sur un temps similaire.
Figure 5 : Résultats des essais pour faire correspondre la séparation chromatographique sur une phase stationnaire Biphe-nyl en utilisant des phases mobiles différentes : (a) une phase mobile acétonitrile, (b) une phase mobile méthanol utilisant le pourcentage de méthanol correspondant à celui sur une colonne de type C18, et (c), une phase mobile avec un pourcent-age de méthanol plus élevé pour tenir compte de la force d’élution augmentée de l’acétonitrile sur la phase stationnaire Biphenyl. Colonnes : Raptor Biphenyl (2.1 x 50 mm, 2.7µm); Pics : 1. uracile, 2. toluène, 3. naphtalène, 4. Biphenyl.
Donc, dans le cas d’une comparaison entre une colonne Biphenyl et une colonne C18, il était toujours possible de tenir compte de la force d’élution augmentée de l’acétonitrile, découlant de son interaction avec la phase Biphenyl elle-même, en augmentant la quantité de méthanol au-delà du pourcentage correspondant prédit pour les colonnes C18.
Pour explorer encore plus l’effet du solvant organique sur la sélectivité en LC, intéressons-nous au métabolite de l’oxycodone, la noroxycodone, et à l’antidouleur dihydrocodéine, sur la colonne Biphenyl en Figure 6. Ces deux composés ont une structure similaire, et les deux ont un cycle aromatique. Nous voyons bien la différence attendue dans la force d’élution, une quantité de méthanol supplémentaire étant nécessaire pour obtenir une rétention similaire à une quantité d’acétonitrile donnée. Mais lorsque l’on essaye de faire correspondre la force d’élution, on remarque un changement dans l’ordre d’élution. Ici, le choix du solvant organique modifie les interactions entre la phase et les analytes, causant un changement de sélectivité.
Figure 6 : Effet du modificateur organique et de son pourcentage sur la sélectivité pour des 2 composés antidouleurs.
En fin de compte, on remarque que changer le modificateur organique et s’attendre à obtenir les mêmes performances chromatographiques n’est pas si simple que ça. Dans les cas où le changement de modificateur organique n’impacte que la rétention « globale » de vos composés d’intérêt, il y a de fortes chances qu’en faisant correspondre la force d’élution à celle de la phase mobile d’origine vous obteniez des performances similaires. Mais si les rétentions relatives des composés (la sélectivité) montrent d’importantes différences, en particulier dans les cas où les pics changent d’ordre d’élution, cela indique qu’il risque d’être compliqué d’obtenir des performances similaires en faisant correspondre les forces d’élution. Parfois, le modificateur organique peut jouer un rôle plus spécifique, dans certaines conditions, en ayant une plus grande affinité pour certains composés en raison d’un mode d’interaction spécifique qu’un autre modificateur organique n’aurait pas (ou à un moindre degré).
Donc, pour savoir si une modification du solvant organique peut vous aider, essayez tout d’abord de garder une composition en pourcentage similaire avant de commencer un quelconque développement de méthodes. Si vous obtenez une sélectivité similaire, mais avec une meilleure rétention « globale », vous pourrez déterminer empiriquement un facteur de conversion entre la composition (en pourcentage) en modificateur organique et la force d’élution, faire les ajustements nécessaires et vous rapprocher de votre objectif.
Si vous obtenez un changement de sélectivité en plus d’un changement dans la rétention “globale”, il est sûr que vous modifierez la manière dont votre méthode sépare vos composés d’intérêt en changeant le modificateur organique.
N’hésitez pas à essayer de modifier les solvants organiques ; si un changement est bénéficiaire pour votre laboratoire, gardez en tête
l’effet du solvant organique sur la sélectivité en LC et rappelez-vous que le choix du solvant organique reste un levier crucial lorsque vos développements de méthodes.
Références
- R.E. Majors, The continuing acetonitrile shortage: how to combat it or live with it, LCGC North America (2009) 27(6) 458-471. http://www.chromatographyonline.com/continuing-acetonitrile-shortage-how-combat-it-or-live-it?id=&pageID=1&sk=&date=