Einfluss des organischen Lösungsmittels auf die Selektivität bei LC-Trennungen
Unterschiedliche organische Modifikatoren für mobile Phasen führen zu unterschiedlichen chromatografischen Ergebnissen. Die Grundlage für gute Trennungen ist die effektive Nutzung der Vielzahl an Chemikalien für mobile und stationäre Phasen zur Erzeugung unterschiedlicher Wechselwirkungen mit den Zielanalyten. In dieser Arbeit werden wir untersuchen, wie Unterschiede in den organischen Modifikatoren die chromatografische Performance bei der Verwendung von Acetonitril oder Methanol mit Reversed-Phase-LC-Säulen beeinflussen. Speziell werden wir uns mit einer klassischen stationären Phase des Typs C18 und mit Biphenyl, einer weiteren gängigen stationären Umkehrphase, befassen. Beginnen wir mit der C18-Phase.
Einer der ersten Unterschiede, den man oft über organische Modifikatoren lernt, ist die "Elutionsstärke", die manchmal als "eluotrope Reihe" dargestellt wird. Die eluotrope Reihe ist einfach eine Liste von Lösungsmitteln in der Reihenfolge ihrer Elutionsstärke. Ein Lösungsmittel mit einer hohen Elutionsstärke ist ein Lösungsmittel, für das die gelösten Stoffe eine hohe Affinität relativ zur stationären Phase haben. Als Folge dieser hohen Affinität verbleiben die Analyten mehr in der mobilen Phase, so dass die Wechselwirkungen mit der stationären Phase reduziert werden, was zu weniger Retention führt. Die Analyten haben normalerweise eine geringere Affinität für organische Modifikatoren mit niedrigeren Elutionsstärken, so dass in diesem Fall bei ansonsten identischen Bedingungen dieselben Verbindungen mehr Wechselwirkungen mit der stationären Phase haben und eine höhere Retention zeigen.
Bezüglich einer eluotropen Reihe für die Reversed-Phase-Chromatografie hat Acetonitril eine höhere Elutionsstärke als Methanol. Daher würden wir erwarten, wie in Abbildung 1 gezeigt, dass bei einem identischen prozentualen Anteil an organischem Modifikator in der mobilen Phase Analyten mit Acetonitril weniger Retention zeigen als mit Methanol.
Aber was, wenn jemand daran interessiert ist, von einem organischen Modifikator zu einem anderen Modifikator überzugehen und dennoch die gleiche Trennung in etwa der gleichen Zeit erreichen möchte. Die Frage ist: Lässt sich das ohne größere Probleme durchführen?
Um vergleichbare Retentionszeiten zu erhalten, müssen Sie aufgrund der unterschiedlichen Elutionsstärken von Methanol und Acetonitril die Menge des organischen Modifikators ändern. Wenn Sie von Acetonitril zu Methanol übergehen, müssen Sie die Gesamtelutionsstärke der mobilen Phase erhöhen, indem Sie den prozentualen Methanolanteil erhöhen. Es gibt Tabellen (siehe z. B. Abbildung 4 in Referenz [1]) mit Schätzungen, welcher Prozentsatz an Methanol z. B. der Elutionsstärke eines bestimmten Prozentsatzes an Acetonitril entspricht. Anhand dieser Tabellen konnten wir eine Zusammensetzung der mobilen Phase mit Methanol ermitteln, die mit der Elutionsstärke und der chromatografischen Performance unter den ursprünglichen Bedingungen mit Acetonitril relativ gute Übereinstimmung zeigte (Abbildung 1).
Abbildung 1: Abbildung 1: Vergleich der Retentionszeiten verschiedener analytischer Reversed-Phase-Proben mit (a) Acetonitril als organischem Modifikator, mit (b) Methanol in der gleichen Zusammensetzung der mobilen Phase und mit (c) einem empirisch ermittelten prozentualen Methanolanteil, dessen Elutionsstärke der Elutionsstärke der Acetonitril-Analyse entspricht. Säule: Raptor ARC-18 (2.7 µm, 50 x 2.1 mm); Peaks: 1. Uracil, 2. Toluol, 3. Naphthalin, 4. Biphenyl.
Wenn Sie also wie in diesem Beispiel von Acetonitril zu Methanol (oder umgekehrt) übergehen möchten, können Sie die Zusammensetzung des organischen Modifikators ermitteln, die der Elutionsstärke der Methode entspricht, die Sie ändern möchten. Dieser Ansatz lässt sich jedoch nicht immer ohne Weiteres verwenden. Die folgenden Cannabinoid-Analysen zeigen, dass der Einfluss des organischen Lösungsmittels auf die Selektivität bei LC-Trennungen nicht immer einfach vorherzusagen ist.
Angenommen wir haben eine Methode in Acetonitril, die wir auf Methanol umstellen wollen. Wenn wir den gleichen Versuch wie im obigen Beispiel durchführen, wobei wir nur die Modifikatoren wechseln und den prozentualen Anteil des organischen Modifikators beibehalten, erhalten wir einen ersten Hinweis darauf, dass die Anpassung der Elutionsstärken allein möglicherweise nicht funktioniert (Abbildung 2).
Als erstes fällt auf, dass der Lauf mit Methanol erwartungsgemäß länger dauert (in diesem Fall sogar wesentlich länger). Methanol ist das Lösungsmittel mit der niedrigeren Elutionsstärke; deshalb ist zu erwarten, dass die Verbindungen später eluieren. Wenn Sie jedoch genau hinsehen, werden Sie feststellen, dass sich eine Reihe von Verbindungen in diesem Beispiel relativ zu benachbarten Verbindungen deutlich verschieben, und in einigen Fällen sogar die Elutionsreihenfolge komplett umändern! Es handelt sich also nicht nur um eine Änderung des Retentionsverhaltens (hohe Elutionsstärke, weniger Retention; niedrigere Elutionsstärke, mehr Retention), sondern auch um eine Änderung der Selektivität (wie Verbindungen relativ zueinander eluieren).
Bekannte Beispiele dafür sind in diesem Fall Trennungen, in denen die sauren Verbindungen (z. B. CBDVA, CBDA, THCVA und CBNA) eine größere Retention zeigen als die entsprechenden neutralen Verbindungen (z. B. CBDV, CBD, TCHV, CBN), wenn Methanol der organische Modifikator ist, verglichen mit Acetonitril. Auch hier ist zu erwarten, dass alle Verbindungen eine größere Retention zeigen, da Methanol der schwächere organische Modifikator ist, aber einige Verbindungen zeigen ein noch größeres Maß an Retention als ihre Nachbarn, wenn Methanol verwendet wird, verglichen mit Acetonitril bei gleicher prozentualer Zusammensetzung.
Abbildung 2: Einfluss des organischen Lösungsmittels auf die Selektivität in der LC, wenn die prozentuale Zusammensetzung beider mobilen Phasen identisch ist; gezeigt am Beispiel häufig analysierter Cannabinoide.
| Peaks | Conc. (µg/mL) | Acetonitrile tR (min) | Methanol tR (min) | |
|---|---|---|---|---|
| 1. | Cannabidivarinic acid (CBDVA) | 50 | 1.877 | 3.117 |
| 2. | Cannabidivarin (CBDV) | 50 | 2.086 | 2.563 |
| 3. | Cannabidiolic acid (CBDA) | 50 | 2.592 | 5.003 |
| 4. | Cannabigerolic acid (CBGA) | 50 | 2.750 | 6.678 |
| 5. | Cannabigerol (CBG) | 50 | 2.912 | 4.373 |
| 6. | Cannabidiol (CBD) | 50 | 3.084 | 4.233 |
| 7. | Tetrahydrocannabivarin (THCV) | 50 | 3.391 | 4.904 |
| 8. | Tetrahydrocannabivarinic acid (THCVA) | 50 | 4.279 | 11.237 |
| Peaks | Conc. (µg/mL) | Acetonitrile tR (min) | Methanol tR (min) | |
|---|---|---|---|---|
| 9. | Cannabinol (CBN) | 50 | 4.609 | 7.643 |
| 10. | Cannabinolic acid (CBNA) | 50 | 5.437 | 17.535 |
| 11. | Δ9-Tetrahydrocannabinol (Δ9-THC) | 50 | 5.815 | 9.866 |
| 12. | Δ8-Tetrahydrocannabinol (Δ8-THC) | 50 | 6.002 | 10.747 |
| 13. | Cannabicyclol (CBL) | 50 | 6.916 | 10.865 |
| 14. | Cannabichromene (CBC) | 50 | 7.263 | 14.387 |
| 15. | δ-9-Tetrahydrocannabinolic acid-A (THCA-A) | 50 | 7.612 | 23.975 |
| 16. | Cannabichromenic acid (CBCA) | 50 | 8.510 | 28.943 |
| Column | Raptor ARC-18 (cat.# 9314A65) |
|---|---|
| Dimensions: | 150 mm x 4.6 mm ID |
| Particle Size: | 2.7 µm |
| Pore Size: | 90 Å |
| Temp.: | 30 °C |
| Standard/Sample | |
| Inj. Vol.: | 5 µL |
| Mobile Phase | |
| Flow: | 1.5 mL/min |
| Detector | UV/Vis @ 228 nm |
|---|---|
| Instrument | Waters ACQUITY UPLC H-Class |
| Notes | Mobile Phase Details Acetonitrile (top) A: Water, 5 mM ammonium formate, 0.1% formic acid B: Acetonitrile, 0.1% formic acid 9 min isocratic run (75%B) Methanol (bottom) A: Water, 5 mM ammonium formate, 0.1% formic acid B: Methanol, 0.1% formic acid 30 min isocratic run (75%B) |
Als nächstes werden wir versuchen, die Elutionsstärken anzugleichen, und sehen, was passiert. Abbildung 3 zeigt die Ergebnisse dieses Versuchs (beachten Sie, dass die Konzentration des Ammoniumformiatpuffers in beiden Fällen unterschiedlich ist; sie wurde jedoch geändert, um identische Gesamtmengen auf die Säule aufzugeben, wie in Abbildung 2). Wir können sehen, dass wir in einigen Fällen – CBN ist ein gutes Beispiel – eine relativ gute Übereinstimmung in der Analyt-Retention erhalten, wenn wir die Elutionsstärke angleichen, aber die in Abbildung 2 beobachtete Änderung der Selektivität ist immer noch vorhanden. Ob eine Anpassung der Elutionsstärken ein effektiver Ansatz ist, wenn es darum geht, ähnliche Ergebnisse mit anderen organischen Modifikatoren zu erzielen, ist in starkem Maße von der Art des Analyten selbst abhängig.
Abbildung3: Einfluss der Verwendung eines anderen organischen Modifikators mit der gleichen Elutionsstärke (durch höhere Konzentration) auf die Selektivität von Cannabinoiden.
| Peaks | Conc. (µg/mL) | Acetonitrile tR (min) | Methanol tR (min) | |
|---|---|---|---|---|
| 1. | Cannabidivarinic acid (CBDVA) | 50 | 1.877 | 1.998 |
| 2. | Cannabidivarin (CBDV) | 50 | 2.086 | 1.700 |
| 3. | Cannabidiolic acid (CBDA) | 50 | 2.592 | 2.803 |
| 4. | Cannabigerolic acid (CBGA) | 50 | 2.750 | 3.479 |
| 5. | Cannabigerol (CBG) | 50 | 2.912 | 2.522 |
| 6. | Cannabidiol (CBD) | 50 | 3.084 | 2.522 |
| 7. | Tetrahydrocannabivarin (THCV) | 50 | 3.391 | 3.030 |
| 8. | Tetrahydrocannabivarinic acid (THCVA) | 50 | 4.279 | 5.876 |
| Peaks | Conc. (µg/mL) | Acetonitrile tR (min) | Methanol tR (min) | |
|---|---|---|---|---|
| 9. | Cannabinol (CBN) | 50 | 4.609 | 4.137 |
| 10. | Cannabinolic acid (CBNA) | 50 | 5.437 | 8.158 |
| 11. | Δ9-Tetrahydrocannabinol (Δ9-THC) | 50 | 5.815 | 5.170 |
| 12. | Δ8-Tetrahydrocannabinol (Δ8-THC) | 50 | 6.002 | 5.605 |
| 13. | Cannabicyclol (CBL) | 50 | 6.916 | 5.605 |
| 14. | Cannabichromene (CBC) | 50 | 7.263 | 6.828 |
| 15. | δ-9-Tetrahydrocannabinolic acid-A (THCA-A) | 50 | 7.612 | 10.969 |
| 16. | Cannabichromenic acid (CBCA) | 50 | 8.510 | 12.399 |
| Column | Raptor ARC-18 (cat.# 9314A65) |
|---|---|
| Dimensions: | 150 mm x 4.6 mm ID |
| Particle Size: | 2.7 µm |
| Pore Size: | 90 Å |
| Temp.: | 30 °C |
| Standard/Sample | |
| Diluent: | Methanol |
| Inj. Vol.: | 5 µL |
| Mobile Phase | |
| Flow: | 1.5 mL/min |
| Detector | UV/Vis @ 228 nm |
|---|---|
| Instrument | Waters ACQUITY UPLC H-Class |
| Notes | Mobile Phase Details Acetonitrile (top) A: Water, 5 mM ammonium formate, 0.1% formic acid B: Acetonitrile, 0.1% formic acid 9 min isocratic run (75%B) Methanol (bottom) A: Water, 7.14 mM ammonium formate, 0.1% formic acid B: Methanol, 0.1% formic acid 13 min isocratic run (82.5%B) |
In unserem Cannabinoid-Fall sind viele Verbindungen mit der größten Änderung in der relativen Retention von Natur aus sauer. Und das werden Sie auch selbst beobachten, wenn Sie es ausprobieren. Manche Verbindungen sind verglichen mit anderen stärker betroffen, und manchmal reicht das aus, um die Selektivität der Analyse zu verändern. In einem Fall wie diesem ist es möglich, dass die Ursache dafür eine zusätzliche Wechselwirkung zwischen dem organischen Modifikator und dem Analyten selbst ist, basierend auf den chemischen Eigenschaften des Analyten.
In unserem ersten Beispiel gab es keine selektive Wechselwirkung aufgrund des organischen Modifikators, die nur eine oder zwei Verbindungen betraf, sodass wir die Elutionsstärken angleichen und die Retention entsprechend anpassen konnten. Wie am Beispiel der Cannabinoide gezeigt, ist das nicht der Fall, wenn verbindungsspezifische Retentionseigenschaften vorliegen. In diesen Fällen können Sie nicht einfach die Elutionsstärke anpassen und erwarten, ähnliche chromatografische Ergebnisse zu erhalten.
Es mag stimmen, dass der Einfluss des organischen Lösungsmittels auf die Selektivität die Performance vielleicht nicht beeinträchtigt, wenn Sie die Peaks korrekt identifizieren können, aber in unserem Beispiel führt die Änderung der Selektivität zu Koelutionen, die für diese LC-UV-Analyse der Cannabisstärke nicht akzeptabel sind.
Aber gilt dies auch Reversed-Phase-Säulen mit anderen chemische Eigenschaften? Bisher haben wir nur eine C18-Säule verwendet, aber wie verhält es sich mit einer anderen beliebten stationären Reversed-Phase wie z. B. Biphenyl? Um dies weiter zu untersuchen, schauen wir uns das erste Beispiel auf der C18-Säule an, die Analyse von Uracil, Toluol, Naphthalin und Biphenyl (Abbildung 1). Dieses Mal werden wir die Bedingungen auf der stationären Biphenyl-Phase rekonstruieren.
Abbildung 4: Einfluss des organischen Lösungsmittels auf die Selektivität in der LC bei zwei verschiedenen stationären Reversed-Phase-Phasen mit identischem Anteil des organischen Modifikators. Beachten Sie, wie sich die Retentionszeit der letzten Verbindung, Biphenyl, bei ansonsten identischen Bedingungen verschiebt, wenn Acetonitril anstelle von Methanol verwendet wird. Säulen: Raptor ARC-18 (2.7 µm, 50 x 2.1 mm), Raptor Biphenyl (2.7 µm, 50 x 2.1 mm); Peaks: 1. Uracil, 2. Toluol, 3. Naphthalin, 4. Biphenyl.
In Abbildung 4 sehen wir, wie erwartet, eine allgemeine Verlängerung der Retentionszeit für alle hydrophoben Verbindungen (Toluol, Naphthalin und Biphenyl) bei Verwendung von Methanol im Vergleich zu Acetonitril (der erste eluierende Peak ist Uracil, das hydrophil ist und in dieser Reversed-Phase-Analyse als Totzeitmarker verwendet wird). Weniger auffällig sind die subtilen Unterschiede in der Retentionszeit, die durch unterschiedliche Lösungsmittel verursacht werden, verglichen mit den Daten der C18-Säule. Schauen wir uns z. B. den letzten Peak an, der in diesem Beispiel eluiert wird, nämlich die Verbindung Biphenyl (nicht die stationäre Phase Biphenyl, sondern der Analyt Biphenyl). Bei Verwendung einer mobilen Phase mit 55% Acetonitril auf der C18-Säule eluiert der Biphenyl-Peak nach 1.7 Minuten, auf der Biphenyl-Säule jedoch eluiert derselbe Peak bei Verwendung der gleichen mobilen Phase mit 55% Acetonitril nach 1.176 Minuten. Es gibt also weniger Retention auf der Biphenylsäule, wenn Acetonitril verwendet wird. Wenn Sie die Daten mit Methanol als organischem Modifikator bei 55% vergleichen, sehen Sie, dass der Biphenyl-Peak auf der C18-Säule nach 5.995 Minuten eluiert, verglichen mit einer Retentionszeit von 7.44 Minuten auf der Biphenyl-Säule. In diesem Fall gibt es also mehr Retention auf der Biphenyl-Säule, wenn Methanol verwendet wird. Woran liegt das?
Dieser Unterschied, den wir in der Retention und der Selektivität zwischen C18- und Biphenyl-Phasen beobachten, wenn wir die organischen Modifikatoren in der mobilen Phase ändern, lässt sich auf unterschiedliche Retentionsmechanismen der stationären Phasen selbst zurückführen. Die stationäre Biphenylphase unterscheidet sich in ihrer Selektivität von einer C18-Phase, weil ihre aromatischen Phenylringe π-π-Wechselwirkungen mit den Zielanalyten eingehen können. Die Polarisierbarkeit der Biphenylphase ermöglicht eine Änderung der Elektronenverteilung in Gegenwart eines Analyten und induziert eine Dipolwechselwirkung. Diese Wechselwirkungen werden am häufigsten bei dipolaren, ungesättigten oder konjugierten Verbindungen beobachtet. Die einzigartige Selektivität der Biphenylphase wird anders als bei einer C18-Phase durch die Wahl des organischen Modifikators beeinflusst.
Von seiner Struktur her besitzt Acetonitril ein zentrales Kohlenstoffatom, das über eine Dreifachbindung an ein Stickstoffatom gebunden ist. Die Dreifachbindung ist ebenfalls in der Lage, zu π-Wechselwirkungen beizutragen oder diese zu stören. Betrachtet man also die Retentionszeit des Biphenyl-Peaks bei Verwendung von Acetonitril als organischem Modifikator, ist das Ergebnis weniger Retention auf der Biphenyl-Säule im Vergleich zur C18-Säule. Wenn Sie jedoch zu Methanol übergehen, einem organischen Lösungsmittel, das keine π-Bindungen aufweist, führt dies zu einer erhöhten π-π-Wechselwirkung zwischen der stationären Phase und den Analyten, was eine andere Selektivität und eine erhöhte Retention auf der Biphenylsäule im Vergleich zur C18-Säule für den Biphenyl-Analyten und in geringerem Maße für Naphthalin zur Folge hat. Acetonitril hat die Fähigkeit, eine zusätzliche Wechselwirkung mit der stationären Phase einzugehen, die bei Methanol nicht vorhanden ist. Diese zusätzliche Wechselwirkung kann die Wechselwirkung der Analyten mit der Phase grundlegend beeinflussen und die Elutionsstärke des Acetonitrils in einem Maße erhöhen, die unsere Erfahrung mit C18-Säulen übersteigt.
Wie wirkt sich dies auf unsere Fähigkeit aus, Elutionsstärken abzustimmen und eine vergleichbare chromatografische Ergebnisse zu erhalten? In Abbildung 5 haben wir zunächst die gleichen Bedingungen ausgewertet, die eine gute Übereinstimmung mit der C18-Säule zeigten (Abbildung 2). Wenn wir versuchen, die gleiche Performance auf der Biphenylsäule unter den gleichen Bedingungen mit identischer Elutionsstärke der mobilen Phase zu erhalten, beobachten wir immer noch mehr Retention, wenn wir Methanol verwenden, allerdings nicht ganz unerwartet. Mit stärkerer Wechselwirkung zwischen der stationären Biphenyl-Phase und dem organischen Modifikator der mobilen Phase ist die effektive Elutionsstärke des Acetonitrils auf der Biphenyl-Säule höher als auf der C18-Säule. Um den Unterschied in der effektiven Elutionsstärke zu berücksichtigen, haben wir den Methanolanteil über den für die ursprünglichen Acetonitril-Bedingungen angenommenen prozentualen Anteil erhöht, und konnten dann sehr ähnliche Ergebnisse in einer ähnlichen Zeitspanne erzielen.
Abbildung 5: Versuch, die chromatografische Trennung auf einer stationären Biphenylphase unter Verwendung verschiedener mobiler Phasen anzupassen: (a) Acetonitril als mobile Phase, (b) Methanol als mobile Phase mit dem gleichen prozentualen Methanolanteil, der gute Ergebnisse auf einer C18-Säule lieferte, (c), eine mobile Phase mit höherem prozentualem Methanolanteil, um die höhere Elutionsstärke des Acetonitrils auf der stationären Biphenylphase zu berücksichtigen. Säulen: Raptor Biphenyl (2.7 µm, 50 x 2.1 mm); Peaks: 1. Uracil, 2. Toluol, 3. Naphthalin, 4. Biphenyl.
Bei der Biphenylsäule im Vergleich zur C18-Säule konnte die erhöhte Elutionsstärke des Acetonitrils, die auf seine Wechselwirkung mit der Biphenylphase selbst zurückzuführen ist, durch Erhöhung des Methanolanteils über den für C18-Säulen vorhergesagten Prozentsatz der Elutionsstärke hinaus also immer noch kompensiert werden.
Um den Einfluss des organischen Lösungsmittels auf die Selektivität in der LC näher zu untersuchen, können wir das Verhalten des Oxycodon-Metaboliten Noroxycodon und des Schmerzmittels Dihydrocodein auf der Biphenylsäule in Abbildung 6 betrachten. Diese beiden Verbindungen sind strukturell ähnlich und besitzen beide einen aromatischen Ring. Wir sehen den erwarteten Unterschied in der Elutionsstärke, wobei mehr Methanol erforderlich ist, um eine ähnliche Retention zu erhalten wie mit einer bestimmten Menge Acetonitril. Wenn wir jedoch versuchen, die Elutionsstärke anzugleichen, ändert sich die Elutionsreihenfolge. Hier beeinflusst die Wahl des organischen Modifikators die Wechselwirkungen zwischen der Phase und den Analyten, was eine Änderung der Selektivität zur Folge hat.
Abbildung 6: Einfluss der Wahl des organischen Modifikators und seines prozentualen Anteils auf die Selektivität für zwei Verbindungen aus der Schmerzmittelgruppe.
| Peaks | Conc. (µg/mL) | |
|---|---|---|
| 1. | Dihydrocodeine | 0.5 |
| 2. | Noroxycodone | 0.5 |
| Column | Raptor Biphenyl (cat.# 9309A52) |
|---|---|
| Dimensions: | 50 mm x 2.1 mm ID |
| Particle Size: | 2.7 µm |
| Pore Size: | 90 Å |
| Temp.: | Ambient |
| Standard/Sample | |
| Inj. Vol.: | 10 µL |
| Mobile Phase | |
| Flow: | 0.8 mL/min |
| Detector | PDA @ 254 nm |
|---|---|
| Instrument | Waters ACQUITY UPLC H-Class |
| Notes | Mobile Phase Details Acetonitrile (top) Analysis run using 5, 10, 15, and 25% acetonitrile mobile phase. A: Water, 0.1% formic acid B: Acetonitrile, 0.1% formic acid Methanol (bottom) Analysis run using 15 and 25% methanol mobile phase. A: Water, 0.1% formic acid B: Methanol, 0.1% formic acid |
Dieselbe chromatografische Performance zu erwarten, wenn ein anderer organischer Modifikator verwendet wird, ist nicht immer eine vernünftige Erwartung. In Fällen, in denen die Änderung des organischen Modifikators nur die Gesamtretention Ihrer Zielanalyten beeinflusst, besteht eine gute Chance, dass Sie durch die Anpassung der Zusammensetzung des organischen Modifikators an die Elutionsstärke der ursprünglichen mobilen Phase eine vergleichbare Performance erzielen. Wenn die relativen Retentionen der Verbindungen. d.h. die Selektivität des chromatografischen Systems, jedoch signifikante Unterschiede aufweisen, besonders in Fällen, in denen sich die Elutionsreihenfolge der Peaks ändert, ist dies ein guter Hinweis darauf, dass die alleinige Anpassung der Elutionsstärken nicht ausreicht, um vergleichbare chromatografische Ergebnisse zu liefern. Manchmal spielt der organische Modifikator bei bestimmten Bedingungen eine spezielle Rolle und hat eine größere Affinität für bestimmte Verbindungsklassen aufgrund spezifischer Wechselwirkungen, die ein anderer organischer Modifikator nicht oder nicht in gleichem Maße eingeht.
Wenn Sie also herausfinden möchten, ob eine Änderung des organischen Modifikators für Sie eine praktikable Option ist, sollten Sie zunächst die prozentuale Zusammensetzung gleichhalten, bevor Sie eine Methodenentwicklung vornehmen. Wenn Sie eine ähnliche Selektivität, aber eine höhere Gesamtretention haben, können Sie möglicherweise aufgrund empirischer Daten einen rechnerischen Zusammenhang zwischen der prozentualen Zusammensetzung des organischen Modifikators und der Elutionsstärke ermitteln, die Anpassung vornehmen und Ihrem Ziel sehr nahe kommen.
Wenn Sie nicht nur eine Änderung der Gesamtretention aufgrund der Elutionsstärke beobachten, sondern auch Änderungen der Selektivität, können Sie sicher sein, dass Sie durch die Änderung des organischen Modifikators auch die Funktionsweise der Trennung Ihrer Zielanalyten wesentlich verändern.
Scheuen Sie sich nicht davor, organische Modifikatoren für die mobile Phase zu ändern, wenn eine Änderung für Ihr Labor angesagt ist. Denken Sie einfach daran, dass das organische Lösungsmittel die Selektivität in der LC beeinflusst und dass die Wahl des organischen Lösungsmittels ein Hebel ist, der bei der Methodenentwicklung von Nutzen sein kann.
Literatur
- R.E. Majors, The continuing acetonitrile shortage: how to combat it or live with it, LCGC North America (2009) 27(6) 458-471. http://www.chromatographyonline.com/continuing-acetonitrile-shortage-how-combat-it-or-live-it?id=&pageID=1&sk=&date=