I fondamentali dell’estrazione in fase solida (SPE)

Sarebbe un sogno poter analizzare qualsiasi campione in modo accurato e preciso senza alcuna preparazione, ma purtroppo non è questa la realtà. Le matrici, che talvolta contengono gli analiti in analisi, spesso possono interferire con le analisi sia qualitative sia quantitative. In caso di matrici e/o analiti particolarmente complessi presenti in concentrazioni molto basse, la diluizione non è più praticabile e sono necessari step più attivi di preparazione del campione.

Le tecniche possibili per la preparazione del campione sono molte, ma una delle più utilizzate è l’estrazione in fase solida o SPE. La SPE può rivelarsi una tecnica molto utile qualora si debbano separare i componenti della matrice dal campione per monitorare gli analiti senza interferenze. Possiamo pensare all’estrazione in fase solida come a una cromatografia liquida senza strumenti o cromatogrammi, in quanto sfrutta gli stessi principi che influenzano le separazioni nei cromatografi liquidi o gascromatografi impiegati per le analisi.

Così come per la cromatografia analitica esistono diverse fasi mobili e stazionarie, anche nel caso dei prodotti e processi SPE ci sono diverse opzioni. Avere più alternative a disposizione per affrontare l’ampia gamma degli scenari di analisi è un grande vantaggio perché non è ancora stata scoperta una procedura di preparazione del campione che funzioni per tutte le applicazioni. Alcuni analisti potrebbero non avere la necessità di sviluppare un metodo SPE perché sono disponibili numerosi prodotti SPE metodo-specifici. Tuttavia, questa varietà di soluzioni potrebbe addirittura disorientare gli analisti che invece devono sviluppare un metodo SPE, e in particolare quelli che si sono approcciati da poco a questa tecnica.

Questo articolo fornisce le indicazioni per prendere la decisione SPE migliore in base ai tuoi obiettivi analitici e al tuo campione. Esamina i principi basilari della SPE, i meccanismi di separazione principali, le strategie e gli obiettivi tipici, i formati e le caratteristiche, i riferimenti incrociati e lo sviluppo del metodo. Poiché non esiste un’unica serie di step da applicare a tutte le situazioni, questo articolo introduce una famiglia di prodotti SPE, a loro volta corredati di istruzioni con guide per passaggi dettagliate.

Estrazione in fase solida: la cromatografia silenziosa

Se devi determinare un nuovo protocollo SPE per il tuo campione perché non esistono esempi pregressi o perché le soluzioni esistenti non sono adeguate per i tuoi obiettivi analitici, è utile tenere a mente che la SPE è essenzialmente un’altra forma di cromatografia in cui non si hanno i vantaggi legati al detector offerti dai cromatografi analitici moderni. Senza il cromatogramma è facile dimenticarsi che la cromatografia avviene all’interno di una cartuccia SPE ed è per questo che spesso soprannominiamo la SPE “la cromatografia silenziosa”.

Il sistema SPE è dotato di una fase mobile, ovvero i solventi utilizzati per lavare via i contaminanti dal campione o per eluire gli analiti di interesse; c’è poi una fase stazionaria che corrisponde al sorbente SPE. Nei protocolli SPE entrano in gioco anche i parametri che influenzano la separazione cromatografica: ci riferiamo per esempio ai concetti di ritenzione, selettività ed efficienza cromatografica, fondamentali per raggiungere la risoluzione desiderata fra gli analiti e i componenti della matrice interferenti.

Infine, la velocità di flusso è fondamentale per garantire che la SPE possa effettuare la separazione in modo efficiente. È necessario che ci siano abbastanza opportunità di interazione con il sorbente per evitare la perdita di saturazione (breakthrough), a causa della quale gli analiti vengono scartati insieme ai componenti della matrice indesiderati.

Come in cromatografia, i metodi SPE efficaci creano condizioni in cui si stabiliscono diversi gradi di interazione fra i componenti del campione e le fasi mobili e stazionarie del sistema SPE. Un primo passaggio importante per lo sviluppo di qualsiasi metodo SPE è quello di comprendere la composizione del campione, perché se non si conoscono le proprietà chimico-fisiche del campione è davvero difficile abbinarlo correttamente a un sistema di solventi e sorbente SPE.

I meccanismi di separazione SPE

Riconoscere i meccanismi primari di interazione che caratterizzano la maggior parte dei prodotti SPE può contribuire a determinare cosa è importante sapere sul campione. La maggioranza dei prodotti SPE sfrutta due meccanismi principali di interazione: polarità e scambio ionico. I prodotti SPE in genere si affidano a uno o a entrambi questi meccanismi, che possono coprire gli intervalli di polarità o di carica e forza dello ione in base alle necessità del campione.

Polarità

Quando si utilizza la polarità per separare gli analiti dalla matrice, una delle prime decisioni da prendere è la modalità da adottare, se normale o inversa. Un sorbente SPE relativamente polare (per esempio la silice nuda, l’allumina o il Florisil) e una fase mobile relativamente non polare (ovvero in modalità normale) possono essere abbinati per trattenere i costituenti polari di un campione durante l’eluizione dei componenti non polari. Per converso, un sorbente SPE relativamente non polare (per esempio la silice con una fase legata C18 o C8) abbinato a una fase mobile relativamente polare si comporterà nel modo opposto. Questa configurazione è da considerarsi una “modalità inversa” perché è l’opposto di una modalità normale, la prima a essere introdotta nello sviluppo di questo tipo di separazioni. Alcuni sorbenti possono operare sia in modalità normale sia in modalità inversa a seconda della scelta del sorbente e del campione (per esempio, CarboPrep Plus, Diol).

Le fasi SPE hanno diversi intervalli di polarità: per esempio, i sorbenti C18 sono dotati di una ritenzione non polare maggiore rispetto al C8. Inoltre, la scelta del solvente di fase mobile spazia su una vasta gamma di polarità, spesso regolabile con l’utilizzo di miscele di solventi, tamponi o altri additivi. Quando si sfruttano le differenze di polarità come caratteristica chiave per separare gli analiti uno dall’altro o dalle interferenze della matrice, è possibile ottenere gradazioni anche estremamente fini.

Se invece si usa la polarità come base per la separazione, torna utile il detto “chi si somiglia si piglia”: più il composto è simile alla polarità di una fase mobile o stazionaria, maggiore è la probabilità di ottenere un’interazione forte. Interazioni più forti con la fase stazionaria portano a ritenzioni più lunghe sullo strumento SPE, mentre interazioni forti sulla fase mobile danno luogo a una minore ritenzione e a eluizioni più rapide.

Scambio ionico

Se gli analiti di interesse presentano sempre una carica o possono essere caricati dalle condizioni della soluzione in cui sono dissolti (come il pH), un altro metodo per separare gli analiti uno dall’altro o dalla matrice è quello di utilizzare strumenti SPE che siano in grado di attirarli con la propria carica.

In questo caso, si applicano le normali leggi dell’attrazione elettrostatica. Diversamente dalle separazioni che si basano sulle caratteristiche della polarità e sul modello di interazione per similitudine descritto sopra, le interazioni tra cariche seguono la regola “gli opposti si attraggono”.

Per esempio, il tuo strumento SPE potrebbe essere dotato di una carica positiva in superficie. Per bilanciare questa superficie caricata positivamente in genere abbiamo un “anione” con carica negativa, che inizialmente è legato alla superficie. Quando viene inserito all’interno del sistema, l’analita con carica negativa è in grado di sostituire l’anione compreso nel legame iniziale interagendo con la superficie SPE con carica positiva. In questo modo si ottiene la ritenzione dell’analita su fase SPE. La sostituzione degli anioni è detta “scambio anionico” ed è solo un esempio della vasta categoria di prodotti SPE a “scambio ionico”. In questo esempio, le specie con carica positiva mostrerebbero una forte tendenza a rimanere nella fase mobile e a non interagire con la superficie SPE a carica positiva, e in questo modo non sarebbero trattenute. Inoltre, a meno che la superficie SPE non sia dotata di ulteriori caratteristiche oltre alle proprietà di scambio ionico, anche le specie neutre mostrerebbero una ritenzione davvero minima. Tuttavia, esistono anche questi prodotti SPE combinati, che permettono di utilizzare i meccanismi di ritenzione a scambio ionico e a fase inversa sullo stesso strumento SPE (per esempio i sorbenti polimerici SPE a scambio ionico).

Un’importante differenziazione da considerare quando si utilizzano i meccanismi a scambio ionico è la natura della carica dell’analita: se l’analita è sempre carico, a prescindere dal pH della soluzione in cui si trova, viene considerato una specie “forte”. Se l’analita è carico solo in alcune condizioni di pH, tale specie viene considerata “debole”. Individuare questa caratteristica dell’analita permetterà di determinare quale tipo di strumento SPE utilizzare. Anche i sorbenti SPE a scambio ionico vengono descritti in termini di “forza” o “debolezza”, e può essere utile tornare a considerare l’attrazione fra opposti: si consiglia di abbinare un sorbente SPE debole a scambio ionico con una specie forte, e un sorbente forte a scambio ionico con un analita debole. Se si abbinasse un analita forte con un sorbente forte, l’attrazione fra i due potrebbe essere troppo elevata per riuscire a ottenere facilmente l’eluizione senza soluzioni basiche o acide molto forti, il cui uso non è sempre opportuno o pratico. Analogamente, l’abbinamento tra una specie debole e un sorbente debole a scambio ionico potrebbe offrire una ritenzione non sufficiente a trattenere l’analita in modo adeguato ed evitare la perdita di saturazione (breakthrough).

Come esempio di un meccanismo a scambio ionico in azione, ipotizziamo che il campione contenga un acido debole (pKa 2-8) che si desidera trattenere sul sorbente SPE. Per utilizzare un meccanismo di ritenzione a scambio ionico, sia l’analita sia il sorbente devono essere dotati di carica. Dato che l’analita acido debole viene abbinato a un sorbente forte a scambio ionico, quest’ultimo non sarà un problema perché presenta una carica essenzialmente permanente. È necessario però che il pH del campione non elimini la carica dell’analita: il pH dovrà avere una differenza di due unità rispetto al pKa del composto, e dato che il nostro esempio è un acido debole, il pH sarà maggiore di due unità rispetto al pKa. In linea generale, gli acidi possono essere considerati come una specie che “rinuncia alla positività” e rimane quindi con una carica negativa. Poiché si desidera trattenere l’analita caricato negativamente (“la base coniugata” dell’acido debole, ovvero un anione) sul sorbente SPE, sarà necessario un prodotto a scambio ionico in grado di attrarre gli anioni, o un sorbente a “scambio anionico”. Per questo esempio specifico consigliamo un sorbente forte a scambio anionico, che tratterà in modo adeguato l’analita con carica finché le condizioni del solvente di eluizione non saranno cambiate a sufficienza per “spegnere” in modo efficiente la carica dell’analita: nel nostro caso servirà un pH inferiore di circa due unità rispetto al pKa degli analiti. A questo punto, l’analita neutro non sarà più trattenuto dal sorbente a scambio ionico e può essere eluito.

In un esempio simile, si verificherà la situazione contraria se il campione contiene una base debole. In questo caso si può parlare di specie che “rinuncia alla negatività”, cedendo una carica positiva all’analita (un “acido coniugato” della base debole, ovvero un catione). Si consiglia di utilizzare un sorbente forte a scambio cationico e di accertarsi che il pretrattamento del campione mantenga l’analita caricato (o circa due unità in meno rispetto al pKa del composto).

Anche se il meccanismo può non risultare chiaro, specialmente per le persone che si sono approcciate da poco a questa tecnica, il sorbente a scambio ionico può essere molto efficace, specialmente se abbinato a un meccanismo di ritenzione basato sulla polarità in una modalità mista come mostrato in precedenza.

Interazioni non caratterizzate della superficie

È importante sapere se è possibile che si verifichino ulteriori interazioni non caratterizzate della superficie che potrebbero influenzare la natura ritentiva complessiva del sorbente in analisi. Troviamo un esempio di questa interazione se prendiamo in esame i diversi tipi di silice che possono essere utilizzati per i sorbenti SPE, in particolare se impiegati con una fase legata (per esempio un ligando C18) in modalità a fase inversa. Consideriamo il caso della silice C18: se la superficie della silice presenta numerosi gruppi silanolo (Si-OH) disponibili per l’interazione con il campione, le caratteristiche complessive di ritenzione del sorbente possono andare oltre la sola ritenzione non polare del ligando C18 prevista. Per questo motivo, molto spesso si indica in nota se un sorbente di silice è “end-capped” o meno. L’end-cap reagisce con i gruppi silanolo esposti e sostituisce il gruppo ossidrilico (-OH) con un gruppo metilico (-CH3), riducendo nettamente la possibilità di interazioni forti con il gruppo silanolo. Oltre ai gruppi silanolo esposti, la presenza di metalli incorporati in una particella di silice potrebbe causare anche interazioni non caratterizzate e rendere quindi più difficile prevedere le prestazioni di ritenzione.

La maggior parte dei fornitori SPE si impegna a offrire prodotti costanti e ben caratterizzati, ma possono comunque esserci differenze tra un fornitore e l’altro, e perfino fra prodotti identici a livello nominale. Per questo motivo è consigliabile verificare le prestazioni quando si cambia fornitore e, in alcuni casi, anche quando si cambia lotto di uno stesso fornitore.

Strategie e obiettivi della SPE

Una volta acquisita familiarità con i meccanismi di base di molti prodotti SPE, il passo successivo è determinare cosa trattenere e cosa eluire. In qualche misura, questa decisione è legata agli obiettivi del metodo SPE, che viene generalmente adottato per uno o più dei seguenti motivi.

Purificazione

La purificazione del campione è l'obiettivo principale della maggior parte dei metodi SPE. Questi metodi danno priorità alla separazione selettiva degli analiti dagli altri componenti della matrice che potrebbero interferire con l'analisi. Separare selettivamente gli analiti target dai componenti della matrice interferenti e/o contaminanti prima di eseguire la separazione analitica può fare una grande differenza. Lo sviluppo di nuovi metodi SPE mira principalmente a ottenere i vantaggi indicati di seguito.

Evitare le coeluzioni con le interferenze della matrice:

Le coeluzioni non sono mai ideali, ma le circostanze in cui si verificano possono influenzarne la gravità. Nel caso delle analisi GC-FID o LC-UV, ad esempio, la coeluzione potrebbe rendere impossibile quantificare l'analita di interesse. Peggio ancora, potrebbe portare a una falsa identificazione perché lo strumento non riesce a distinguere il picco interferente dall'analita target.

Anche gli utenti di MS e MS/MS possono essere influenzati negativamente. Anche se un MS può essere in grado di risolvere lo spettro di un composto dalle interferenze coeluenti, questi componenti coeluenti della matrice possono ancora sopprimere o migliorare l'ionizzazione degli analiti target, producendo segnali distorti in difetto o in eccesso. Questo tipo di effetto può essere particolarmente problematico perché potrebbe non essere osservato direttamente. Solo confrontando i risultati di standard di calibrazione realizzati con cura in una matrice rappresentativa e veramente bianca (cioè una matrice che non contiene già nessuno degli analiti) con gli standard realizzati in solvente puro è possibile misurarlo direttamente. In gran parte, gli standard di calibrazione accoppiati alla matrice sono necessari per correggere questo effetto, ma sarebbe utile anche se questi componenti interferenti della matrice potessero essere rimossi dal campione prima dell'analisi.

I componenti coeluenti della matrice possono anche causare problemi alle linee di base. Questo effetto può emergere anche quando le interferenze della matrice non oscurano il picco di interesse. I componenti coeluenti della matrice possono rendere le linee di base abbastanza instabili da rendere difficile un'integrazione automatica efficiente. Le linee di base instabili possono rendere necessario impostare manualmente i parametri di integrazione, picco per picco. Ciò può comportare costi aggiuntivi in termini di tempo e carico di lavoro.

Nel migliore dei casi, i componenti coeluenti della matrice sono solo una seccatura, ma nel peggiore dei casi possono portare a imprecisioni non rilevate nei risultati riportati. Tuttavia, ci sono alcuni modi per affrontarli se compaiono nell'analisi.

Se il campione contiene relativamente pochi analiti target in una matrice relativamente pulita, potrebbe essere sufficiente ottimizzare le separazioni analitiche. Tuttavia, se la matrice è troppo complessa e/o l'elenco degli analiti target è troppo lungo, l'ottimizzazione non sarà sufficiente. Quando il cromatogramma diventa troppo fitto, è necessario un modo per "sfoltirlo" selettivamente prima della separazione analitica. La SPE potrebbe fornire la soluzione.

Evitare interazioni indesiderate con le interferenze della matrice:

Alcune matrici eluiscono con gli analiti target, creando problemi durante la rilevazione, mentre altre non eluiscono affatto e rimangono lungo il percorso del campione (per esempio negli iniettori GC, nelle colonne LC o GC, ecc.). In questi casi, i componenti della matrice di un campione precedente potrebbero creare una nuova, indesiderata occasione di interazione con gli analiti target. Questo può causare una variazione di ritenzione per i composti target, rallentandone il passaggio nel sistema cromatografico e portando a forme del picco distorte (scodamento del picco). In alcuni casi, tali componenti indesiderati possono perfino reagire con i composti target, innescando reazioni chimiche che danno origine a composti del tutto nuovi, non presenti originariamente nel campione. Se questa degradazione avviene prima della colonna analitica, può dar luogo a nuovi picchi; se avviene all'interno della colonna analitica, può portare a una distorsione del picco. È essenziale cercare di evitare questa contaminazione del sistema dovuta alla matrice, perché pregiudica la qualità dei dati. È possibile contenere tali effetti diluendo il campione, ma in questo modo anche gli analiti target risultano diluiti. Se con la diluizione il problema non è risolto, si può considerare l'utilizzo della SPE.

Eliminare i tempi di inattività degli strumenti causati dalle incrostazioni della matrice:

Con il tempo, l'accumulo di contaminazione da matrice su uno strumento GC o LC può creare problemi. Nel breve periodo, le interazioni indesiderate fra gli analiti target e la contaminazione da matrice possono essere evitate, ma nel lungo termine è molto probabile che sorgano problemi che richiederanno tempi di inattività e manutenzione degli strumenti.

Nella migliore delle ipotesi, l'hardware e i consumabili dello strumento danno buone prestazioni tra un intervento di manutenzione preventiva di routine e il successivo, ma non è raro che emergano criticità con un lotto di campioni fra una manutenzione programmata e l'altra. In questi casi, è necessario effettuare manutenzione e ricalibrazione, spegnendo uno strumento che invece serve avere operativo.

Frazionamento

Il paragrafo precedente tratta della necessità di separare gli analiti target dai componenti della matrice potenzialmente contaminanti o interferenti. In altri casi, invece, è utile separare gli analiti fra loro prima di eseguire un’analisi quantitativa.

Ma cosa succede se un campione contiene due classi di composti diverse, per esempio composti alifatici e aromatici in applicazioni di idrocarburi del petrolio estraibili (EPH)? Ogni classe deve essere trattata con il proprio metodo analitico. In questo caso, utilizzare un’estrazione in fase solida può aiutare a realizzare una prima separazione di massima. La SPE fraziona e quindi prepara il campione per le separazioni ottimizzate del cromatografo analitico.

Concentrazione

Spesso i tecnici cromatografici devono affrontare la sfida di monitorare concentrazioni di composti target estremamente basse, talvolta ben al di sotto dei limiti di quantificazione affidabile della strumentazione disponibile. In questi casi è necessario individuare un modo per concentrare il campione prima dell’analisi. Supponendo che ci sia una quantità di campione sufficiente per procedere, una buona soluzione è quella di creare un metodo SPE su misura che trattenga fortemente gli analiti ma allo stesso tempo permetta di eluire la maggior parte della matrice. Una massa rilevabile di analiti target può essere raccolta e poi trasferita in un vial per l’analisi con il solvente di eluizione.

Strategie SPE

È possibile descrivere le strategie SPE attraverso due domande: “cosa succede agli analiti?” e “in che modo questo è in linea con gli obiettivi?” In sostanza, il sorbente SPE trattiene qualcosa, mentre qualcos’altro viene eluito separatamente. Fra le due conviene concentrarsi sugli analiti.

Se l’obiettivo primario è quello di separare gli analiti dai composti interferenti della matrice, il metodo più semplice è utilizzare un sorbente SPE che trattiene fortemente la matrice, ma non gli analiti, per i quali invece si userà un forte solvente di eluizione. Questo metodo di “passaggio dell’analita” permette che l’estratto venga eluito tramite il sorbente SPE e raccolto, preparandolo potenzialmente per l’analisi.

Spesso però la natura del campione è tale che la migliore separazione degli analiti dalle interferenze della matrice si ottiene con la “cattura degli analiti”. Utilizzando un sorbente SPE che trattiene gli analiti fortemente, ma non troppo, la matrice viene lavata via e gli analiti vengono eluiti introducendo un forte solvente di eluizione per analiti. Questo approccio di cattura degli analiti è essenziale per il frazionamento del campione se l’obiettivo della SPE è quello di effettuare una separazione iniziale degli analiti, e si rivela imprescindibile per concentrare gli analiti prima dell’analisi.

Formati e Caratteristiche SPE

È consigliabile approcciarsi allo sviluppo del metodo SPE partendo dallo studio delle caratteristiche del campione, definendo gli obiettivi della preparazione del campione e poi selezionando i sorbenti e i solventi SPE che consentiranno la separazione degli analiti target dalle interferenze. Tuttavia, ci sono alcune decisioni pratiche da prendere riguardo al formato del metodo SPE. È comune trovare diverse specifiche di sorbenti nelle descrizioni dei prodotti, quindi è importante conoscere come queste diverse caratteristiche possano influenzare le prestazioni di un dato prodotto.

Per quanto riguarda i formati, ci sono diverse opzioni tra cui scegliere, alcune delle quali più utilizzate di altre.

• Cartucce: Un formato molto comune per i prodotti SPE è la cartuccia, utilizzata sia nei sistemi manuali che in quelli automatizzati. Consiste principalmente in un corpo di cartuccia contenente uno o più letti di sorbente(s) compressi tra fritti che mantengono il letto in posizione, e un serbatoio sopra il letto di sorbente per il campione e i solventi di condizionamento o di eluizione da aggiungere. Le cartucce sono disponibili in molte dimensioni diverse, quindi è importante considerare la dimensione del serbatoio della cartuccia rispetto al volume del campione da estrarre. È anche importante notare la dimensione del letto di sorbente rispetto alla massa del sorbente SPE, poiché questo influenzerà la capacità di ritenzione della cartuccia. Il serbatoio sarà abbastanza grande per contenere il volume del campione che deve essere analizzato? Il letto di sorbente sarà sufficientemente capace di trattenere senza causare un breakthrough indesiderato?
• Piastre da 96 pozzetti: Comunemente utilizzate nei laboratori ad alta produttività che preparano quotidianamente grandi quantità di campioni, il design generale della piastra a 96 pozzetti è simile alla cartuccia, con un letto di sorbente tra fritti e un serbatoio sopra per contenere il campione e i solventi di lavaggio/eluizione. La differenza è che ciascuno dei 96 pozzetti funge da cartuccia singola, semplificando la gestione di grandi quantità di campioni. L'uso di una piastra a 96 pozzetti di solito implica che non sono necessari viali e tappi, il che è conveniente poiché la piastra SPE a 96 pozzetti si adatta sopra un'altra piastra di raccolta a 96 pozzetti. La scelta di una piastra a 96 pozzetti sarà probabilmente predeterminata poiché questo formato di solito include una serie di altre attrezzature specializzate, da pipettatori ad autosampler.
• Estrazione Dispersiva in Fase Solida (dSPE): Sviluppata come un modo relativamente rapido e semplice per pulire gli estratti raccolti usando metodologie QuEChERS, la dSPE implica l'aggiunta del sorbente SPE direttamente all'estratto del campione, seguito semplicemente da agitazione e centrifugazione prima dell'analisi. I prodotti dSPE sono di solito sviluppati per abbinarsi con estrazioni QuEChERS e sono quindi focalizzati sul mercato della sicurezza alimentare per cui QuEChERS è stata originariamente sviluppata.
• Preparazione del Campione In Linea (ILSP): Per applicazioni LC-MS e LC-MS/MS, è possibile incorporare uno step di pulizia del campione "in linea" con l'analisi effettiva attraverso l'aggiunta di una cartuccia contenente un sorbente compatibile con le condizioni analitiche LC. In questo caso, il campione viene iniettato nello strumento e passa inizialmente attraverso la cartuccia ILSP. La separazione degli analiti dalla matrice avviene nella cartuccia ILSP. Successivamente, una volta che gli analiti sono stati eluiti dalla cartuccia ILSP sulla colonna analitica, ma prima che avvenga l'eluizione dei componenti della matrice, un sistema separato di pompe e valvole devia il flusso attraverso la cartuccia ILSP. Gli analiti procedono attraverso la colonna analitica per la rilevazione, mentre un solvente di lavaggio effettua il controlavaggio della cartuccia ILSP verso gli scarti, preparandola per l'iniezione successiva.
• Dischi: Per alcune applicazioni specifiche (ad esempio, la concentrazione di campioni d'acqua potabile nel monitoraggio di pesticidi clorurati, contenenti benzidina o azoto), il materiale del sorbente è inserito in un formato a disco di vetro o PTFE. Questo formato è spesso specificato nei metodi (ad esempio, i metodi U.S. EPA 515.2 e 553). I dischi sono utili anche per pulire campioni che potrebbero altrimenti ostruire il formato cartuccia. Inoltre, poiché il flusso raccomandato attraverso i dischi è generalmente molto più alto rispetto a quello attraverso la cartuccia, grandi volumi di campione (ad esempio 1 L) possono essere puliti in meno tempo utilizzando un disco SPE.
• Massa: Alcuni sorbenti SPE sono venduti alla rinfusa per i clienti che preferiscono creare i propri apparati di preparazione del campione. A meno che il cliente non abbia un motivo specifico per acquistare sorbenti alla rinfusa, questo non è un formato comune per lo sviluppo tipico del metodo SPE.

Oltre alla configurazione del formato, anche i materiali di costruzione sono importanti per la compatibilità con il campione e per la possibilità di produrre interferenze indesiderate. Anche le cartucce in plastica di alta qualità potrebbero non essere sufficientemente resistenti per alcuni campioni, quindi potrebbe essere necessario un prodotto in vetro inerte. Inoltre, anche se i materiali dei fritti realizzati con composti come il PTFE sono generalmente estremamente inerti, se l'analisi include il monitoraggio a bassi livelli di sostanze poli- o perfluoroalchiliche (PFAS), potrebbe essere necessario scegliere un'altra opzione per evitare contaminazioni di fondo.

Caratteristiche di rilievo della SPE

Dopo aver identificato un potenziale meccanismo di separazione da utilizzare (polarità, scambio ionico o entrambi) e un sorbente da testare, ci sono diverse caratteristiche aggiuntive della SPE che possono essere indicate nella descrizione di un prodotto. Queste caratteristiche possono influenzare le prestazioni di un metodo, quindi è utile capire perché sono così importanti da essere presenti nella descrizione di un prodotto.

Ecco un elenco di specifiche comuni e come potrebbero influenzare le prestazioni di un metodo SPE.

Caratteristiche del sorbente

• Caratteristiche delle particelle: È raro trovare particelle di dimensioni diverse o con dimensioni/volumi dei pori disomogenei tra i prodotti di uno stesso fornitore; è possibile però che emergano differenze confrontando fornitori diversi. Se la dimensione dei pori delle particelle in questione è sufficiente per consentire l'ingresso degli analiti target, allora, nella maggior parte dei casi, le dimensioni delle particelle e dei pori sono le caratteristiche più rilevanti quando si considerano le seguenti due caratteristiche: area superficiale e carica di carbonio.
  • Nota: Le dimensioni delle particelle possono essere espresse sia con una misurazione diretta, come ad esempio una particella da 60 μm, sia in "numero di mesh". Il numero di mesh è una misura del numero di aperture in un pollice lineare della maglia: un numero di mesh più alto indica aperture più piccole.
• Area superficiale (generalmente espressa in m²/g): Definita dalla dimensione delle particelle e dalle dimensioni e dal volume dei pori della particella, rappresenta la superficie disponibile per le interazioni con il campione mentre attraversa il sorbente. Maggiore è l'area superficiale, maggiore è la ritenzione. I sorbenti che riportano dimensioni delle particelle più piccole e dimensioni dei pori più ridotte avranno maggiori aree superficiali per grammo rispetto a quelli con particelle e pori più grandi.
• Carica di carbonio (generalmente espressa come % della massa totale del sorbente): Simile e correlata all'area superficiale è il concetto di carica di carbonio. Alcuni sorbenti SPE hanno una sostanza chimica legata alla superficie della particella. Un esempio classico è un ligando C18 legato alla superficie di una particella di silice, che rende la particella di silice di fase normale un sorbente SPE di fase inversa grazie alla capacità del C18 di trattenere composti non polari. In questi casi, il valore della carica di carbonio indica la copertura superficiale del ligando legato ed è un indicatore di quanto ritenzione avrà quel sorbente. Questo numero è meglio usato come punto di riferimento: i sorbenti con cariche di carbonio più elevate avranno, massa per massa, un maggiore potenziale di ritenzione rispetto a quelli con una carica di carbonio inferiore.
• Capacità di scambio ionico (generalmente espressa in mEq/g): La capacità di scambio ionico di un sorbente è una misura di quanti siti sono disponibili per lo scambio di controioni debolmente legati, catturando altri ioni nel campione. Sebbene un'esplorazione dettagliata dell'unità comunemente usata, i milliequivalenti/grammo, sia al di là dello scopo di questo articolo, in termini generali, maggiore è il valore, maggiore è la capacità del sorbente di trattenere specie caricate nel campione.

Caratteristiche della cartuccia

• Volume di hold-up: Il volume di hold-up di un prodotto SPE è la quantità di solvente necessaria per eluire una specie non trattenuta. Questo concetto può essere riconosciuto con termini come "volume/tempo di hold-up" o "volume/tempo morto" in riferimento ai sistemi cromatografici analitici.
• Capacità di carico: La capacità di carico di un sorbente SPE è una stima della quantità di materiale che può trattenere ed è generalmente espressa come circa il 10% del peso del letto di sorbente. Tuttavia, questa stima presuppone il trattenimento di un composto che è trattenuto molto bene dal sorbente utilizzando un solvente debole. Molti fattori influenzano la capacità di carico finale (ad esempio la natura del campione, il solvente, la velocità di flusso, ecc.), quindi la capacità di carico effettiva potrebbe essere molto inferiore per composti che non interagiscono con il meccanismo di separazione principale del sorbente o che vengono eluiti con solventi molto forti. Come indicato di seguito, il modo più affidabile per saperlo per il metodo/campione SPE è determinare empiricamente la capacità di carico.

 

Usa come guida le istruzioni fornite con il prodotto SPE

Viste le grandi differenze fra i diversi tipi di campioni, analiti e analisi, non esiste un unico metodo SPE che funzioni per tutti. Quindi, dopo aver esaminato il campione e averlo abbinato a un prodotto SPE adatto, per raggiungere i tuoi obiettivi analitici dovrai fare riferimento alle istruzioni specifiche di quel prodotto e apportare le ottimizzazioni necessarie.

Il valore della sperimentazione nello sviluppo del metodo SPE

Si consiglia di condurre diversi esperimenti durante lo sviluppo del metodo per comprendere dove si trovano tutti gli analiti di interesse in ciascun passaggio del metodo SPE. Questi esperimenti ti consentiranno di perfezionare l’analisi permettendoti di:

• Validare la scelta di sorbente e solventi.
• Utilizzare la quantità minima possibile di prodotto SPE per raggiungere gli obiettivi del metodo.
• Accertarti che gli analiti non vadano persi durante gli step di caricamento e di lavaggio a causa della perdita di saturazione (breakthrough) del campione.
• Essere certo che gli analiti non rimangano sul sorbente perché non vengono eluiti in modo efficace nelle condizioni adottate.

Normalmente, due esperimenti da condurre sarebbero lo studio del “bilancio di massa” e quello della “perdita di saturazione” (breakthrough), entrambi necessari solo durante lo sviluppo del metodo per accertarsi che il processo sia adeguato per i campioni in analisi.

Bilancio di massa: Questo studio aiuta a misurare il movimento degli analiti durante l’intero processo SPE, e prevede la raccolta di tutto quanto eluisce dal prodotto SPE in ogni step del processo. Condurre questo studio con campioni preparati in modo accurato che simulano fedelmente la composizione dei campioni reali confermerà che si sta trattenendo ciò che si vuole trattenere ed eluendo ciò che si vuole eluire in ogni step del procedimento.

Perdita di saturazione (breakthrough): Questo studio viene svolto utilizzando una gamma di volumi del campione (con la stessa concentrazione di analiti) che comprende il volume desiderato per il metodo sviluppato. In ogni caso, il campione viene caricato e il processo SPE eseguito. Dopo l’aggiunta dei diversi volumi di carico, si procede con il protocollo SPE e vengono raccolti gli estratti per l’analisi. La percentuale di recupero viene calcolata in base alla concentrazione e al volume totale utilizzato in ciascun caso. Se sorge un problema di ritenzione, i risultati elaborati dovrebbero mostrare i punti in cui i diversi composti, nelle condizioni di carico, vanno incontro alla perdita di saturazione e vengono persi durante il caricamento del campione. Occorre prestare attenzione che il volume venga caricato alla stessa velocità per ogni campione, in modo che l’efficienza di retenzione non venga modificata a causa della velocità di carico.

Hai bisogno di aiuto per sviluppare un metodo SPE?

Ci sono molte decisioni da prendere per delineare un metodo SPE, ma le basi fornite in questo articolo definiscono i primi step da cui partire. Possiamo pensare all’estrazione in fase solida come a una cromatografia che ha un nome diverso. Quindi, se addentrandoti nello sviluppo di un metodo SPE dovessero sorgere domande specifiche sulla matrice, gli analiti target e l’analisi, consideraci a tua disposizione per un aiuto: la cromatografia è la nostra specialità.

Contattaci subito per qualsiasi domanda sull’utilizzo della SPE nel tuo laboratorio.