内径3mmの中容量（IV）注入口ライナーによるナローボアGCカラムの性能向上について

高効率のナローボアカラムの利点を最大限発揮するには、サンプル導入についても最適化することが不可欠です。 この記事では、中容量ライナーを使用することによってもたらされるクロマトグラフィーと 再現性の改善について、以下のアプリケーションをもとに説明します。 半揮発性有機化合物 (SVOC） 多環芳香族炭化水素 (PAHs) 農薬 「全体的な評価」を見る

IVライナーのイントロダクション                        

分析時間が短縮されると生産性が向上しますが、これはクロマトグラフィーの性能が、より正確なピークの同定と定量が可能である場合に限ります。ナローボアカラム（内径0.25 mm未満）は、カラム効率が高く、ピークの識別が容易な高くてシャープなクロマトグラムが得られます。ナローボアカラムの高いカラム効率は、カラム流量を減らすことで達成され、これにより分析物がカラム固定相と相互作用する時間が増えます。これらの相互作用は、より薄い液相と短いカラム長で発生するため、分析物は狭く対称的なピークとして迅速に溶出します。ナローボアカラムを使用することは、一般的なGC-MSセットアップで高速かつ高効率なクロマトグラフィーを達成する良いアプローチですが、その有効性はサンプル導入によって制限されます。

サンプル導入を制御するためには、さまざまな注入口が利用可能ですが、もっとも一般的なツールはスプリット/スプリットレス注入口です。同様に、多くの注入口ライナーの形状や内径が利用可能ですが、ほとんどのスプリット/スプリットレス注入口には、内径（ID）が約2 mm（「小容量」）または約3.5～4 mm（「大容量」）のライナーが使用されます。ナローボアカラムでは、小さなライナーがより速いサンプル移送と導入を提供し、カラムの効率をさらに補完しますが、それぞれの内径には考慮すべき利点と欠点があります（Table I）。小容量ライナーと大容量ライナーの選択は、最終的には、サンプル注入量とクロマトグラフィーの性能の観点でトレードオフする場合があります。

Table I: 異なるサイズの注入口ライナーの利点と制限

	メリット	デメリット
小容量ライナー	ライナー内の滞留時間が短いと、サンプル導入時間が早くなり、分析対象物のバンドが狭くなる。スプリットレスのホールド時間が短縮される。 分析対象物のバンドが狭いと、揮発性化合物の分離能が向上する。 活性化合物がライナー内に留まる時間を短縮し、吸着や反応性などの有害な相互作用が軽減される。	ライナーの体積が小さくなると、注入できるサンプル量が減り、感度と再現性の低下を引き起こす可能性がある。 溶媒の気化体積が、ライナーの体積を超えると、バックフラッシュが発生し、ピーク形状が悪化し、結果のばらつき、注入口の汚染の可能性がある。
大容量ライナー	ライナーの体積が大きいと、注入できるサンプル量も増え感度と再現性が向上する。 ライナーの体積が大きいと、気化体積の高い溶媒（水など）にも対応でき、バックフラッシュの可能性が低くなる。	ライナーの体積が大きくなると、カラムへのサンプル移送に時間がかかり、ピーク幅の増加、ピーク高さ低下に繋がる。 ナローボアカラムはカラム流量が低いため、ライナー内のサンプル滞留時間が長くなり、分析種の分解に繋がる可能性がある。

メソッドの検出限界を下げて、感度を高める必要がある場合は注入量が重要です。注入量を増やすことで、カラムへのサンプル負荷量を増やすことができ、前処理の手順を変更する必要もなくなります。これは注入したサンプルをすべてカラムに導入するスプリットレス注入によって実現できます。ただし、スプリットレス注入時での注入量を最大化すると、注入口の温度、圧力、および分析物の溶解度に大きく影響を与え、クロマトグラフィーの品質が低下する可能性があります。これらのパラメーターバランスをとるのは簡単な作業ではありませんが、そのような場合にRestekの溶媒気化容量カリキュレータ（solvent expansion calculator) が役立ちます。Figure 1は、ナローボアカラムと組み合わせることができる注入口の条件下で、異なるライナーサイズで計算された注入量の最大値を示しています。もちろん、溶媒によって結果は異なりますが、一般的に小さなライナーは0.5〜1 µLを保持できるため、検出限界が足りない場合は、大容量ライナーを選択します。ただし、大容量ライナーの容量増加はカラム効率の低下が伴います。大容量ライナー内を流れる分析物は、ナローボアカラムの入口に向かって、非常に遅い速度で移動するためピークが広がり、また分析物がライナーと相互作用する時間を与えてしまいます。これは特にエンドリンやDDTなどの注入口ライナーとの相互作用で分解する化合物にとって有害となる可能性があります。

 

IVライナーがよりバランスの取れた解決策を提供

ナローボアカラムユーザーにさらなる柔軟性を与え、バックフラッシュのリスクやピーク特性を損なうことなく最大のサンプルを注入できるようにするために、Restekは中容量のIVライナー（内径3 mm）を開発しました。小容量（2 mm）ライナーと比較して、IVライナーは溶媒気化体積を含む大幅な余裕があるため、注入量を2倍にすることができます。また、大容量（4 mm）ライナーよりも速いサンプル移送力を持つため、分析物は注入口内に滞在する時間が短く、良好なクロマトグラフィー性能が維持されます。

IVライナーの利点を実証するために、半揮発性有機化合物（SVOC）、多環芳香族炭化水素(PAHs)、および農薬を対象に、ナローボアカラムと組み合わせて使用した3種類のライナー（IVライナー/小容量ライナー/大容量ライナー）の性能を比較しました。全体として結果は、IVライナーの中容量がクロマトグラフィーとナローボアカラムでのスプリットレス注入の再現性を大幅に改善しました。これらの検証は、AgilentのGC装置に適した形状での内径2、3、および4mmのライナーを比較したことに注意してください。Thermo TRACE 1300および1600シリーズ、PerkinElmer Clarus 590/690およびGC2400、Scion 8300および8500、Scion/Bruker/Varian 1177、およびLucidity GC、Shimadzu 17A、2010、2014、および2030 GCと互換性のあるIVライナーも利用可能であり、同様の結果が得られます。

半揮発性有機化合物（SVOC）の分析

半揮発性有機化合物のクロマトグラフィー性能への中容量IVライナーの影響を評価するために、ナローボアのRxi-SVOCmsカラム（20 m × 0.15 mm ID × 0.15 µm; カタログ番号 46616）と組み合わせました。このカラムが選択された理由は、特に半揮発性化合物の寿命、不活性、一貫性、および分離能の向上を目的として設計されているからです。ナローボアカラムを使用すると、カラムは短い分析時間で同じ分離能が得られますが、重要な分離を維持するにはサンプルの導入が不可欠になります。溶媒の影響や間違ったライナーを選択をしてしまうと、ピークの広がりが発生し、分離が失われる可能性があります。

この評価では、1 ～ 10 µg/mL に希釈した 51 種類の半揮発性化合物 (カタログ番号 31899、31825、31826、および 32418) のピーク特性と分離能を調べました。ライナー容量を超えずに他のライナーサイズと性能を比較するために、小容量（カタログ番号 23316）および中容量（カタログ番号 27231）のライナーには0.5 µL の注入を 6 回行い、大きい容量（カタログ番号 23303）のライナーには1 µL の注入を 6 回行いました。化合物と注入パラメーター全体でピーク面積、高さ、幅、分離能、テーリングを比較することで、半揮発性有機化合物の分析に IVライナーを使用することの重要な利点を特定することができました

中容量と大容量ライナーでの1 µL注入を比較すると、中容量IVライナーを使用した場合、ほとんどの化合物においてピーク面積と高さが大幅に向上しました（Student’s t-test, p < 0.05）。この結果は、ピークの同定と定量が容易であり、より正確になりました。Figure 2に示すように、IVライナーを使用した場合、92% の化合物がより大きな平均ピーク面積を示し、80% がより大きな平均ピーク高さを示しました。ピーク幅、分離能、および対称性は、ほとんどの化合物において大容量ライナーの結果と統計的に有意と見られる違いはありませんでした。これは、溶媒の影響により、両方のライナーを使用した場合、一部の溶出の早い化合物のピーク形状が悪くなることが原因であると考えられます（Figure 3）。 注入するサンプルの量を減らした場合、溶出の早い化合物のパフォーマンスが向上しました。また、全体として、遅く溶出する化合物についてもパフォーマンスが向上しました（Figures 4–5）。これは、IVライナーのカラムへのサンプル移送が高速化した結果と考えられます。

0.5 µL 注入では、小容量ライナーと中容量ライナーを比較したところ、その差はより劇的でした。IVライナーを使用した場合、分析対象のすべてのピークパラメーターで統計的に有意な改善が示されました（Figure 2）。これらの利点は、狭いサンプル移動帯域を提供し、溶媒ピークからの分離を維持する IVライナーに起因すると考えられます。性能の向上は、ベンゾ[b]フルオランテンやベンゾ[k]フルオランテンなど、近くに溶出する沸点の近い半揮発性有機化合物の分離を向上させるのに特に有益でした（resolution of 1.83 vs. 1.93 on the 2 mm and 3 mm liner, respectively, p < 0.05）。半揮発性有機化合物分析において、IV注入口ライナーは、ナローボアカラムに変換しても、良好なピーク形状と分離を提供し、高不活性で高効率の Rxi-SVOCms カラムを最大限に活用できるようになりました。

 

 

 

多環芳香族炭化水素（PAHs）の分析

PAHの評価では、包括的なPAHの分析に最適化されたナローボアのRxi-PAHカラム（40 m × 0.18 mm内径 × 0.07 µm; 品番49316）を選択しました。このカラムは、ベンゾ [b]、[k]、および [j] フルオランテンを含む重要な化合物を分離しながら、より重いPAHを短い分析時間で溶出することが実証されています。PAH試験は、1 µg/mL に希釈した 31 種類の化合物 (カタログ番号 31899 および 32547) を使用して行われ、半揮発性有機化合物の実験で使用したのと同じライナーサイズと注入量を使用して分析を行いました。

1 µL注入の場合、大容量のライナーと比較して、中容量の IVライナーを使用すると、やはり改善が見られました。全体的な定量的評価ではPAHの 94% でより大きなピーク面積が得られ、74%でIVライナーの方がより大きなピーク高さを示しました (Figure 6)。半揮発性有機化合物の比較と同様、これらの結果は両方とも統計的に有意でした。クロマトグラフィー性能の一例として、Figure 7にピーク面積、高さ、対称性の向上を示します。大容量ライナーを使用した場合と比較して、IVライナーがナローボアカラムへより効率的なサンプル移送を行い、遅く溶出する化合物においても同様の効果が確認されました。    

IVライナーと小容量ライナーを比較した結果はより複雑でした。半揮発性有機化合物の結果とは対照的に、PAHのピーク面積と高さは、IVライナーよりも小容量ライナーの方が統計的に高くなりました。これは、ライナーに関係なく、Rxi-PAHカラム全体でのPAHの保持力が高いことに起因するためと考えられます。興味深いことに、これらの結果は統計的に有意ではありませんでしたが、ピーク幅と分離に関しては、IVライナーを使用した場合、大部分のPAHで定性的によりシャープなピークと高い分離能が得られました。Figure 8は、ピーク高さが小さくても、IVライナーで得られたより狭いピークにより、小容量ライナーを使用した場合よりも PAHのピークの対称性と分離能が向上したことを示しています。全体として、IVライナーは、ナローボアカラムでのPAH分析に重要な利点をもたらしました。

 

 

農薬の分析

最後の実験では、中容量のIVライナーが農薬分析のナローボアカラムの性能を向上させることができるかどうかを評価しました。このアプリケーションでは、20 種類の農薬（カタログ番号 32279、32280、32281、32282、および 32418）を1 ～ 10 µg/mL で含む標準物質をRxi-5ms カラム （20 mx 0.18 mm ID x 0.18 µm; カタログ番号 13402）で分析しました。Rxi-5msは、低ブリードケミストリーで強化された汎用カラムで、さまざまなアプリケーションでの分析に適しています。注入量とライナーのサイズは前の実験と同じものを使用しました。    

1 µLの注入では、IVライナーを使用するとパフォーマンスの向上が再び見られました。Figure 9は、中容量のIVライナーを使用した場合、より大容量のライナーと比較してピーク面積と高さが統計的に改善されたことを示しており、この結果は半揮発性有機化合物およびPAHの実験と一致しました。ピーク幅、分離能、および対称性は、ライナーの体積間で大幅に変化しませんでした。Figure 10は、大容量ライナーと比較して、IVライナーを使用した場合に得られるピーク高さの増加を示しています。IVライナーにより、ライナー内のサンプル移送が早くなることでピークの識別が大幅に改善されました。

0.5 µL注入の結果は、IVライナーを使用するとピーク面積と高さが大幅に減少するという点でPAHの結果と同様でしたが、大部分の化合物でピーク幅、分離能、対称性に関して改善が見られました （Figure 9）。しかし、統計的な違いはありませんでした。ピーク面積と高さの減少は、小容量ライナーよりも中容量ライナーでは、カラムへのサンプル移送がわずかに低下するためと考えられます。定量的ではありませんが、IVライナーで観察された主な改善の 1 つは、クロマトグラムの初期のピーク分割が減少したことです （Figure 11）。すべてのライナーと容量の組み合わせでは、早期に溶出する化合物である程度のピーク分割が見られましたが、中容量のIVライナーを使用して 0.5 µL を注入した場合に分割が最も減少しました。ピーク分割と溶媒の影響が減少するため、早期に溶出する化合物のピークの同定と定量は改善されるはずですが、ピーク分割を完全に排除するにはさらに多くの調整が必要です。Restek の GC トラブルシューティング ビデオ シリーズでは、 peak splitting（ピーク分割） やその他の問題を軽減するための役立つヒントが提供されています。全体として、0.5 µL注入の場合、追加容量と溶媒ピークからの距離によりピーク分割が最小限に抑えられるため、IVライナーは早期溶出の農薬にとって最も効果的な選択肢であることが示されました。

 

 

再現性

再現性を評価するために、すべての実験で得られた全化合物の平均パラメータの相対標準偏差（%RSD）を、異なるライナーサイズと注入量で比較しました（Figure 12）。 全体的に、中容量のIVライナーは、ナローボアカラムでのピーク面積と高さについて、部分容量と全容量の両方で、統計的に優れた再現性を示しました（Table II）。 ピーク対称性の結果も、統計的な差がなかった0.5µL注入と、より大容量のライナーを使用した場合の対称性が0.1%しか改善されなかった中容量の比較を除き、IVライナーを使用すると再現性が高くなります。ピーク幅と分離能に関しては、ほとんどの比較で性能に統計的な差はありませんでしたが、0.5 µL注入では小容量ライナーの方が再現性の高い結果が得られ、1.0µL 注入ではIVライナーの方が再現性の高いピーク幅が得られました。幅と分離能はクロマトグラム内の位置 (溶出の初期と後期、または等温分析など) によって大きく影響されるため、これらのパラメーターの違いはライナー以外のメソッド条件により大きな影響を受ける可能性があります。

これらの再現性の向上は、IVライナーの中間容積に起因すると考えられます。IVライナーには、より小さい容積のライナーの能力を押し上げる可能性のある注入量がより適切に含まれます。同様に、化合物は大容量ライナーよりもIVライナーからカラムに効率的に移送されるため、特に後から溶出する化合物の場合に変化が生じる時間が短縮されます。

 

Table II: 異なるピークパラメータにおける優れた再現性（統計的に有意な平均% RSD値が低い、p < 0.05）ライナー。

ライナーID	面積	高さ	幅	分離能	テーリング
0.5 µL 注入（IV vs 小容量）	IV	IV	小容量	小容量	ND
1 µL 注入（IV vs 大容量）	IV	IV	IV	ND	IV
Full capacity（IV vs 小容量）	IV	IV	ND	ND	IV
Mid-capacity（IV vs 大容量）	IV	IV	ND	ND	大容量

ND = 統計的な差異なし（p > 0.05）

全体的な評価

Table IIIは、これらすべての実験の統計結果をまとめたものです。スプリットレス注入＋ナローボア GC カラムの組み合わせの場合、ライナーの選択がクロマトグラフィーの性能にどのように影響を及ぼすかのレベル評価を示しています。50 件の比較のうち、43 件 (86%) では、中容量のIVライナーを使用することで小容量と大容量ライナーと比較し改善された (22/50) または同等の (21/50) 性能を提供することが示されました。結果はピーク面積とピーク高さが最も顕著であり、これらは正確なピークの同定と定量化に重要です。ピーク幅、分離能、対称性においては、効果がさまざまでしたが、これらのパラメータは他のメソッド条件 (温度、カラム液相、溶解度など) や溶出時間によっても強く影響される可能性があります。

このデータに基づいて、IVライナーは小容量および大容量ライナーよりも、よりバランス改善されたクロマトグラフィー性能を提供します。ナローボアカラムとIVライナーを使用すると、小容量ライナーよりも多くのサンプルを注入できるため、溶媒とライナー容量による制限が軽減されます。さらに、大容量ライナーと比較して、サンプルがより速く、より狭いバンドでカラムに導入されるため、カラム固有の高い効率を効果的に活用できます。    

結論として、IVライナーの中容量は、ナローボアカラムの高速で感度が高く、高い再現性の分析に貢献し、ラボがナローボアカラムの利点を最大限に活用できるようサポートします。既存の方法をナローボアカラムに切り替える場合は、ピークの分離を維持するために他のパラメータを適切にスケーリングすることが重要です。Restekの無料オンラインソフト、Pro EZLCメソッドトランスレーターは、ナローボアカラムのための適切なカラムサイズや、メソッドを構築するための迅速で簡単なツールです。    

Table III: ここで評価された実験比較の86％（43/50）が、ナローボアカラムでIVライナーを使用した場合の性能が改善されるか、統計的な差があるかを示しました。    

	性能の最も優れたライナー (p < 0.05)
	面積の増加	高さの増加	ピーク幅の減少	分離能の向上	テーリングの減少
半揮発性有機化合物
IV vs. larger (1 µL)	IV	IV	ND	ND	ND
IV vs. smaller (0.5 µL)	IV	IV	IV	IV	IV
多環芳香族炭化水素（PAH）
IV vs. larger (1 µL)	IV	IV	ND	ND	ND
IV vs. smaller (0.5 µL)	smaller	smaller	ND	ND	ND
農薬
IV vs. larger (1 µL)	IV	IV	ND	ND	ND
IV vs. smaller (0.5 µL)	smaller	smaller	ND	ND	ND
再現性
IV vs. larger (1 µL)	IV	IV	IV	ND	IV
IV vs. smaller (0.5 µL)	IV	IV	smaller	smaller	ND
Full capacity (smaller vs. IV)	IV	IV	ND	ND	IV
Mid-capacity (larger vs. IV)	IV	IV	ND	ND	larger

ND = ND = 統計的な差異なし（p > 0.05）