Pro EZ LC Chromatogram Modelerを使用したLC-MS/MSメソッド開発の加速

• 高精度なシミュレーション機能により、メソッドの開発時間とコストを大幅に削減
• 実験室の装置を稼働することなく、シミュレーションを用いてLCカラムや分析条件の検討・メソッド開発が可能
• リアルタイムでメソッドパラメータを微調整し、効果を即確認、重要な分離のパフォーマンスを最適化

メソッド開発は、LC-MS/MS ラボにおいて最も重要である一方、時間とコストがかかる作業の 1 つです。従来、メソッドを実験的に確立し、ルーチンサンプル分析での高い再現性を確保するためには、多くの時間や設備、専門知識が必要でした。しかし現在では、Restek の Pro EZLC Chromatogram Modelerを使用して、信頼性の高いメソッド開発を短時間で行うことができます 。この無料のクロマトグラム シミュレータを使用すると、研究室で機器を専有することなく、迅速かつ簡単に分離を開発できます。この記事では、乱用薬物の一連の化合物を例として、この強力なフリーシミュレーションツールを使用した LC-MS/MS メソッド開発の簡素化、スピードアップする方法を説明します。

ラボベースと Pro EZLCメソッド開発の比較

研究室であっても、クロマトグラムシミュレータを使用していても、LC-MS/MS メソッド開発の最初のステップは、分析目標を設定することです。感度、分析時間、分離度の要件は、ラボや分析手法によって異なります。たとえば、速度を犠牲にしてでも、クリティカルペアの分離度を確保することが、あるアプリケーションにとっては不可欠なケースもあるでしょう。一方で、別のケースでは、サンプルスループットの目標達成を第一優先事項として、分析時間の短縮が必要とされるかもしれません。そのため、実際のラボワークにおいては、分析条件の開発を始める前に、各アプリケーションに対する必要要件を精査する必要があります。

一般的な機器ベースの LC-MS/MS メソッドの開発には、クロマトグラフィー条件、質量分析計のパラメータ、およびサンプル前処理手順の最適化に費やす時間が含まれます (Figure 1)。Pro EZLC Chromatogram Modelerを使用したメソッド開発は、分離の最適化、プレカーサおよびプロダクトイオンの特定、および各化合物の正しいモードの選択にかかる作業が、シミュレーションを活用することで数分で完了します。Pro EZLCであれば、簡単な入力だけでシュミレーションが完結します。LC モデルは、Restek の科学者によってすでに生成された堅牢なアルゴリズムと実験データに基づいています。これにより、クロマトグラフィー メソッドを迅速に最適化できるため、MS パラメータやサンプル前処理手順の最適化など、メソッド開発の他の側面により多くの時間を費やすことができます。また、時間の節約はメソッドバリデーションフェーズへの速やかな移行を可能とし、結果として、ルーチンサンプル分析といった実際の作業をより早く開始できることも意味します。

 

分離度、スループット、感度に関する分析目標が設定された後は、実験室で最適な条件を検証するため、実際にメソッド作成を終了するまでに数日から数週間を費やすことがあります。その際、機器、カラム、およびその他関連リソースの、別作業での利用は制限されることになります。一方、クロマトグラムシミュレータを使用すると、作業者は溶液を調製したり、カラムを取り付けたり、分析結果を待つことなく、簡単かつ速やかにパラメータ変更の影響を調査・確認することができます。さらに、異なる固定相およびサイズといったカラムに関わる評価も非常に簡単に実施できるため、手元にないカラムでも、シミュレーションで確認、それらが対象の成分に対して機能するかどうか、購入前に事前確認をすることもできます。感度の評価、サンプル調製、MSの最適化、およびマトリックス効果の評価は依然として実験室で行う必要がありますが、Figure 2は、無料の Pro EZLCソフトウェア を使用することの利点（時間やリソースの節約、簡便さ）を示しています。

効果はある? 試してみましょう!

クロマトグラム シミュレータを使用すれば、ラボベースのメソッド開発よりも迅速にメソッドの最適化が可能です。しかしながら、その利点はモデラーが実際の結果を正確に予測する場合にのみ実現されるという点は注意が必要です。例として、Pro EZLCソフトウェアを使用して乱用薬物のメソッドを開発し、モデル化された結果と実験室で生成された結果を比較してみました。

化合物タブで化合物名と固定相を選択します。

Pro EZLC Chromatogram Modelerは、 [化合物]、 [分析条件]、および [My EZLC] の 3 つのタブ付きセクションで構成されています 。作業は [化合物] タブから始まります。Figure 3は、モデルの作成に使用する入力フィールドを示しています。まず最初に、 化合物クラス (3A) を選択し、次に個々の化合物 (3B) をクリックして対象化合物のリストを作成します。対象化合物は既存リストをスクロール、または、検索ボックスに化合物名 (または CAS 番号) を入力して選択を行います(3C) 。ツール内ではヘルプ ファイル (3D) も利用でき、特定のタスクについての詳細な手順も確認することができます 。

 

ここから、次の 15 種類の乱用薬物を用いた例を紹介します。これらの化合物は、クロマトグラフィー領域の広い範囲、言い換えると幅広い保持時間 (溶出の早いものから遅い化合物まで) をカバーし、同重体以外にも分離が難しい化合物を含んでいます。

1. コデイン
2. N-デスメチルタペンタドール
3. O-デスメチル-シス-トラマドール
4. デソモルヒネ
5. デキストロメトルファン
6. ジヒドロコデイン
7. メタンフェタミン
8. モルヒネ
9. モルヒネ-N-オキシド
10. ノルコデイン
11. ノルモルヒネ
12. ノルオキシコドン
13. オキシモルフォン
14. ペンタゾシン
15. ペンタゾシン

このリストには、同じ分子量を共有する 4つの同重体化合物のグループが含まれています: デソモルヒネ/デキストロメトルファン/ノルモルヒネ (m/z 272)。ジヒドロコデイン/モルヒネ-N-オキシド/ノルオキシコドン/オキシモルフォン (m/z 302); モルヒネ/ノルコデイン/ペンタゾシン (m/z 286); およびメタンフェタミン/フェンテルミン (m/z 150) Pro EZLC Chromatogram Modelerは同重体を分離 (3E) するため、これらの化合物を効果的に識別、青いボックス内の白いチェックで自動的に警告を表示します。同重体化合物の分離に関して事前に確認することができるため、ユーザーはメソッド開発の過程で同重体を見落とす心配がなく、必要であれば化合物の選択を解除するだけでリストから除外するもできます。同重体の分離では、分離度だけでなくスループットに関する目標を考慮しつつ最適化することも重要なポイントになります。特定の化合物がそれほど重要ではない場合、または異なるフラグメンテーションイオンによって区別できる場合、分離度の選択を解除することで分析時間が大幅に改善される可能性があります。 (特定の化合物ごとに青いボックス内の白いチェックマークを外して分離したい同重体の選択を解除することは、モデルに含めるための化合物の選択を解除することとは異なるのでに注意してください。)

化合物タブでの最後のステップは、 評価したい固定相 (3E) を選択することです。  固定相の選択リストは、Restek のサイエンティストがすでに化合物ライブラリを収集して検証したものに限定されています。固定相選択の自由度は限定されますが、これにより、ユーザーが特定の対象分析物に適していないカラムを選択することを防ぎます。化合物リストでは、C18 よりも広範囲の化合物を分離できるBiphenyl固定相を選択します。Biphenylは C18 と比較して芳香族選択性が高く、多くの場合同重体を含む困難な分析物を分離します。さらに、Biphenylが有するより強力な保持力により、溶出の早い化合物に発生しがちな、マトリックスに由来するイオン化抑制の低減にも役立ちます。固定相を選択後、モデル生成ボタン (3G) をクリックすると、モデル化された結果がクロマトグラムモデルビュー領域 (3H) に表示されます。モデルが生成されると化合物タブの下部に追加のメッセージがいくつか表示されることに注意してください。また、モデルに関するサポートについてテクニカルサービスへ直接リクエストいただくことも可能です。特に、リストに掲載されていなかったため、モデルに追加できなかった化合物についてはリクエストをお願いします。不足している化合物はすぐには利用できませんが、将来的にModelerへの追加が検討されます。

初期モデルの評価

化合物リストに対して Pro EZ LC ソフトウェアによって生成された最初のモデル分離をFigure 4に示します。自動生成された条件に対して、唯一行った変更はDelay Volumeをデフォルトの0.25 mLから0.38 mLに調整したことだけです。Dwell Volumeについては、この記事の後半で最適化条件検討の際に追加で説明を行いますが、この変更は、ラボ装置のDwell Volumeと合わせ、モデルの精度を評価する目的で行いました。初期モデルを評価し、実際にラボで再現実験を実施した後に、さらに最適化を実施します。

 

初期モデルの具体的な結果 (Figure 5) を詳しく見ると、クロマトグラム シミュレータがシンプルなグラジエントで ほとんどの化合物の分離を達成しており、かつ分析時間としては7.4分のモデルを生成したことがわかります。モデルの下にあるピークリストの表には、保持時間、分離度、ピーク幅、溶出 %B、イオン化モード、一般的なモニターイオンなど、すべての化合物の追加情報が表示されます。

初期モデルでは、メタンフェタミン/フェンテルミンとジヒドロコデイン/ノルオキシコドン/O-デスメチル-シス-トラマドール/コデインの 2 つのグループの共溶出が予測されました。ピークリスト情報から、最初のグループの化合物 (メタンフェタミン/フェンテルミン) はプレカーサ―イオンとプロダクトイオンの両方を共有していることがわかります。そのため、これら成分を個別に報告する必要がある場合は、結果の正確さを保つためにクロマトグラフィーの分離が不可欠です。ただし、2 番目のグループでは、4 つの化合物すべてが異なるフラグメンテーションプロダクトイオンを持っているため、共溶出が認められたとしても MS によって区別できます。同重体化合物の共溶出の程度をより適切に視覚化したい場合は、選択可能な同重体リストから目的の同重体イオンを選択して表示します (Figure 6)。

化合物情報に加えて、Pro EZLC Chromatogram Modelerは、作成した分析条件が、一般的なHPLC システムの圧力制限を超える可能性があるという有用な警告も発します。また、ボイドタイム (T0) も表示されるため、溶出の早い化合物とT0の間に適切な分離が保てているかどうかを考慮することで、マトリックス効果を最小限に抑えることができます。

 

モデル化された結果を確認後、Pro EZLC ソフトウェアで仮想的に作成した分離が、どの程度正確に再現できるのか、実際に実験室の装置を用いて再現試験を行いました 。Figure 7は、Pro EZLC ソフトウェアが作成した条件を用いた、ラボのLC-MS/MS による再現試験の結果を示しています。実際のラボでの再現試験においては、連続分析を行うにあたり、注入前の平衡化が必要となります。そのため、分析サイクルには再平衡化ステップが追加されていることに注意してください。ソフトウェアで生成された結果と実際の結果を比較すると、すべての化合物が同じ順序で同様の保持時間で溶出しました。共溶出パターンも同様でしたが、予測されたメタンフェタミン/フェンテルミンの共溶出は、ラボが所有するRaptor Biphenyl カラムと装置を用いた再現試験では分離が確認されました。モデル段階で共溶出している化合物が、実分析で分離されるケースを経験することもあるかもしれません。これは、Pro  EZLC Chromatogram Modelerが保守的かつ分離度を慎重に見積もるように設計されているためです。

「分析条件」タブでモデルを最適化する

Pro EZ LC ソフトウェアによって生成された初期モデルは、実際のラボ装置へのスムーズな移管・実装が可能で、かつ、優れた結果が得られることが示されました。一方、必要に応じて、Figure 4に示す分析条件タブインターフェイスを使用し、さらに最適化することもできます。  次の例では、初期モデルを最適化して分析時間を短縮を試みた結果を示します。

メソッドを改良する最も速い方法は、  [グラジエントの最適化] ボタン (4B) をクリックすることです。これを繰り返し実行して、現在の条件をベースにグラジエントを変更し、分離度と分析時間をさらに改善できる場合もあります。あるいは、分析者は、ユーザー入力フィールド (4C) にあるパラメータを変更することで、より高度なメソッド最適化を実施ですることも可能です。ユーザーはカラムサイズ、システム容量 、有機溶媒移動相、カラム温度、グラジエントプログラム、および分離度を変更できます。これらのフィールドパラメータを手動で変更すると、その効果をモデルビューと結果フィールドの両方で即座に確認することが可能です (4E)。

最適化の際は、特定の分析目標と、各ユーザー入力セクションの変数に関する以下の情報を慎重に考慮してください。加えた変更がモデル化された結果にどのような影響を与えるのかを確認することも分析対象物の分離傾向を知るうえでとても重要となります。Pro EZLC Chromatogram Modelerを使用すれば、ラボで何日も時間を費やすことなく、簡単かつ迅速に、ベストなカラム選択や、圧力といった使用装置の制限を考慮した結果を、リアルタイムで確認できるようになります。

• カラム
  

  カラムサイズを選択する場合、より短く内径の細いカラムを選択すると、溶媒節約、分析時間の短縮、サンプルスループットの向上が期待できます (分離要件が満たされている限り)。より高い分離度が必要な場合は、分析時間が長くなるというデメリットがあったとしても、より長いカラムを選択することも考慮したほうがよいでしょう。ただし、Pro EZLC Chromatogram Modelerによって提示される選択肢には、対象分析物に対して良好な結果が得られることが実証されているカラムのみが含まれており、選択可能なカラムフォーマットが限定的であることに注意してください。Modelerの結果は Restekカラムでのみ検証されているため、カラム性能に影響を与えるシリカの仕様、結合様式、充填プロトコルなどが異なる他メーカーのカラムを用いた場合にはモデルの再現ができない場合があります。そのため、リストに記載されていないカラムフォーマットが必要な際は、Restekカラムの同シリーズから目的に合致したものを選択いただくか、また、弊社テクニカルスタッフまでお問い合わせください。
  
  

• ボリューム効果
  

  Dwell Volume とカラム外容量は、それぞれ保持時間とピーク幅に影響を与える装置固有の値です。Pro EZLC Chromatogram Modelerはこれらのフィールドで一般的なデフォルト値を使用しますが、それらを使用している装置の正確な値に変更すると、分析に使用される装置に対してより正確なモデルを生成するのに役立ちます。これらの容量を見つけるには、装置マニュアルを参照するか、機器のメーカーに問い合わせてください。これらの容量がモデル化された結果にどのような影響を与えるか、また、お使いの装置でのそれらの容量を決定する方法の詳細については、Pro EZLCインターフェイスのヘルプボタンをクリックし、確認してください。
  
  

• 移動相
  

  移動相の有機溶媒を選択するときは、溶媒の相対的なユートロピック強度を考慮する必要があります。これは、保持と選択性の両方に影響を与える可能性があるためです。アセトニトリル (非プロトン性溶媒) はメタノール (プロトン性溶媒) よりも溶出強度が高いため、他のすべてが同じであれば、アセトニトリルを使用すると分析物はより早く溶出されます。特にマトリックスの影響排除やVoid Volume付近での分析対象化合物の溶出といった、早期溶出への対策として保持を改善したい場合は、メタノールがより良い選択となる可能性があります。逆に保持を弱めたい場合は、メタノールの量を増やすか、アセトニトリルに切り替えることを検討してください。溶媒選択の変更は、全体的な保持に影響を与えるだけでなく、化合物の特性によっては(例: 移動相によってプロトン化状態が変わるようなケース)、相対的な保持 (選択性) や溶出順序にも変化を与えるでしょう。Pro EZLC Chromatogram Modelerによって提示されるカラムの選択の場合と同様、移動相の選択は、Restek のサイエンティストによってテストされ、ターゲット分析物に対して適切に機能すると判断された有機溶媒のみであることに注意してください。
  
  移動相の有機溶媒を選択することに加えて、Pro EZLC Chromatogram Modelerでは、カラム温度 (最大 60 °C) を変更することも可能です。温度の上昇は、溶媒粘度の低下させるため、それに伴い背圧の低下が観察されるかもしれません。一方、温度の低下はその逆の現象を引き起こします。そのため、カラム温度を選択するときは、カラムと装置の温度制限ならびに背圧上限に常に注意してください。
  
  

• グラジエント条件
  

  Pro EZLC グラジエント条件では、 デフォルトのターゲット分離度が 1.50 に設定されていますが、ユーザーのニーズに合わせて変更できます。すべての同重体化合物でターゲット分離度が満たされていない場合、Modelerはターゲット分離度フィールド の横に 警告記号 (  ) を表示します。初期グラジエントはソフトウェアによって自動的に提供されますが、 グラジエントの最適化ボタンを利用するか、手動で設定することで変更ができます 。グラジエント条件を追加するにはグラジエントステップ数の値を変更します。
  
  Modelerは自動的に新しいステップを挿入し、元のグラジエントプログラムの傾きを維持する値を割り当てますが、値は調整可能なため、自由にグラジエントプロファイルの傾きを変更できます。さらにグラジエントの開始点と終了点にホールド条件も追加できます。連続分析の際に必要なシステムのリセットに役立つように、再平衡の条件を最後に追加することもできます。これは実際のラボ分析では必要なステップですが、モデリング段階では再平衡化の配慮は不要かもしれません。グラジエント条件に変更が加えられると、クロマトグラムシミュレータは値を自動的に更新することに注意してください。グラジエントを生成する場合、ソフトウェアはまず、最も近接して溶出している同重体のターゲット分離度を満たすことを試み、次に、共溶出する同重合体化合物が可能な限り少なくなるようにしながらも、最速の分析時間を提供する設計となっています。

再度、乱用薬物の例に戻ります。次に、分析時間を短縮するために初期モデルを最適化することにします。分析を高速化するため、有機溶媒移動相をアセトニトリルに変更し、分析初期条件のホールド時間を設定、2 つのグラジエント ステップを追加して%B 値を変更、さらに流速を上げました。前述したように、ラボで使用する装置に合わせて、Delay Volumeはすでに 0.38 mL に変更されています。Figure 8のモデル化された結果に示されるように、ここで最適化した条件は、最初の分析条件 (7.4 分) を大幅に短縮することができています (3 分)。分析を半分以下まで短縮できたためサンプルスループットが大幅に向上する一方、共溶出が予測されるフェンテルミンとメタンフェタミンでは分離度の低下が観察されました。

 

クロマトグラムシミュレータの精度を評価するための最終ステップとして、速度が最適化されたモデル条件を用いてラボでの再現実験を行いました (Figure 9)。ここでも、Pro  EZLC ソフトウェアは溶出順序を正確に予測し、保持時間を厳密に予測しました。モデルではフェンテルミンとメタンフェタミンは共溶出が予測されましたが、実際のラボ再現実験でも共溶出が観察されました。フェンテルミンとメタンフェタミンは同じプロダクトイオンを共有する同重体化合物であるため、MS による区別ができません。そのため、ユーザーはこれらの特定の化合物を分析におけるリスクを考慮したうえで、速度と分離、どちらが優先となるのかを自分で判断する必要があります。

Pro EZLC ソフトウェアならメソッド開発をスピードアップかつシンプルに

ここに示すように、クロマトグラムシミュレータを使用すると、LC-MS/MS メソッドの開発を効果的かつ効率的に行うことができます。Restek のPro EZLC Chromatogram Modelerは無料な上に、何らかのデータをユーザーが準備する必要もありません。実際の分離を数秒で正確に予測するため、従来の実験室ベースのアプローチに比べてほんのわずかな時間でクロマトグラフィーメソッドを開発できます。 Pro EZLC ソフトウェアはメソッド開発をシンプルにし、時間と費用の節約を大幅に改善します。特に、実際の作業者にとってはクロマトグラフィーパラメータを変更して効果を即座に確認できるようになるため、作業の効率化も期待できるでしょう。Pro EZLCで作成した初期モデルをラボで実装、または分離度やスループットに関してさらに最適化を実行するかどうかに関わらず、この強力なツールは、より迅速でシンプルなメソッド開発の基盤となり得ます。この無料ツールを使用すれば、次世代型メソッド開発の扉を、どなたでも開けることができます。Restekが提供するPro EZLC ソフトウェアは、ユーザーのみなさまの研究やビジネスを、新たな試みでサポートするための最適なパートナーです。