分析時間5.5分のLC-MS/MSを用いたピーナッツパウダー中マイコトキシン分析

• より高いサンプルスループットのための高速分析
• 優れた分離により12種類の規制対象マイコトキシンの精度が向上
• 迅速で簡単なサンプル調製　(希釈-ろ過-注入)

農産物で繁殖する特定の真菌は、マイコトキシンとして知られる有毒な代謝物を産生します。現代の食品加工工程ではこれらの化合物が存在しても完全に除去できないため、厳しいモニタリング手法が確立されています。マイコトキシン分析の汎用法が開発される際には非常に効率的なスクリーニングが採用されることになるでしょう。しかしマイコトキシンの物理化学的性質の違いや、抽出効率、マトリックス効果によりこのようなメソッドを開発することは非常に困難です。Dr. Zhangらは多様なマトリックス中の様々なマイコトキシンの分析に広く適用できる分析手順を提供することを目的として、複数機関における共同研究[1]を公開しました。この研究にヒントを得て、従来型HPLC機器の耐圧範囲でFDAの規制対象である12種のマイコトキシンを分離する、後述のLC-MS/MS法を開発しました。

この例では、ピーナッツパウダーをマトリックスとしてマイコトキシンを分析しました。比較的短いカラム、Biphenyl固定相の選択性、効率的な2.7μmのRaptor表面多孔質（コアシェル）粒子を使用することで5.5分（1サイクルではトータル7分）という迅速な分析時間で優れた分離が得られました。マイコトキシンHT-2の感度の良いMRMトランジション447.3-285.3にマトリックス由来化合物の共溶出が観察されたため、定量には447.3-345.3を選択しました。感度を向上させるために、マイコトキシンのイオン化を促進するアンモニウム緩衝液を使用しました。参考文献で研究された12種のマイコトキシンにおいてRaptor Biphenyカラムは非常に有効でしたが、類似の構造を持つアイソバリックなマイコトキシンを含む、さらに多数の化合物群においては、充分なクロマトグラフィー分離にRaptor FluoroPhenyl固定相が必要となる場合があります。

このメソッドは、様々なマトリックス（ここで示したピーナッツパウダーに加えてコーンミールや玄米粉といった複数の由来を含む）を対象としたバリデーション研究で評価された、FDAの規制対象である12種のマイコトキシンに対して、優れた精度と精確さを示しました。Restekはこのプロジェクトを通して技術サポートしていただいたDr. Zhangに感謝申し上げます。

	Peaks	tR (min)	Conc. (ng/g)	Precursor Ion	Product Ion 1	Product Ion 2
1.	Deoxynivalenol	0.62	50	297.3	249.3	231.2
2.	Fumonisin B1	2.45	50	722.5	352.4	334.5
3.	HT-2	2.60	50	447.3	345.3	285.3
4.	Fumonisin B3	2.85	50	706.5	336.4	318.4
5.	Fumonisin B2	3.23	50	706.5	336.3	141.2
6.	T2	3.31	50	489.3	245.2	387.4

	Peaks	tR (min)	Conc. (ng/g)	Precursor Ion	Product Ion 1	Product Ion 2
7.	Aflatoxin G2	3.74	5	331.2	313.3	189.3
8.	Zearalenone	3.96	50	319.3	283.3	187.2
9.	Aflatoxin G1	4.22	5	329.2	243.2	200.2
10.	Aflatoxin B2	4.43	5	315.3	287.3	259.2
11.	Aflatoxin B1	4.99	5	313.3	285.2	241.2
12.	Ochratoxin A	5.19	5	404.2	239.3	358.3

Matrix interference was observed for HT-2 transition 447.3-285.3 in peanut powder. Therefore, 447.3-345.3 was chose for quantification.

Column	Raptor Biphenyl (cat.# 9309A52)
Dimensions:	50 mm x 2.1 mm ID
Particle Size:	2.7 µm
Pore Size:	90 Å
Guard Column:	Raptor Biphenyl EXP guard column cartridge 5 mm, 2.1 mm ID, 2.7 µm (cat.# 9309A0252)
Temp.:	40 °C
Standard/Sample
Inj. Vol.:	5 µL
Mobile Phase
A:	Water, 2 mM ammonium formate, 0.1% formic acid
B:	Methanol, 2 mM ammonium formate, 0.1% formic acid
	Time (min) Flow (mL/min) %A %B %C 0.00 0.5 70 30 0.6 0.5 70 30 0.7 0.5 50 50 3.0 0.5 25 70 4.5 0.5 25 75 5.0 0.5 10 90 5.2 0.5 10 90 5.21 0.5 25 75 6.00 0.5 25 75 6.01 0.5 70 30 7.00 0.5 70 30

Detector	MS/MS
Ion Mode:	ESI+
Mode:	MRM
Instrument	UHPLC
Sample Preparation	Weighed 1.00 gram of peanut powder in a 50 mL centrifuge tube and added 2.00 mL of water. Vortexed at 3000 rpm for 5 min followed by the addition of 4.0 mL of extraction solvent (50:50 water:acetonitrile, v/v). The tube was then vortexed at 3000 rpm for 5 min followed by centrifugation for 15 min at 4200 rpm. 475 μL of the supernatant was filtered through a Thomson SINGLE StEP Nano filter vial (0.2 μm, cat.# 25882). The sample was then fortified with 25 μL of a standard solution prepared in water at 1000 ng/mL (100 ng/mL for aflatoxins and ochratoxin A) as part of the matrix-matched calibration curve. Vortexed at 3000 rpm for 1 min prior to analysis.
Notes	Want even better performance when analyzing metal-sensitive compounds? Check out Inert LC columns at www.restek.com/inert.

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参考文献

1. K. Zhang, M.R. Schaab, G. Southwood, E.R. Tor, L.S. Aston, W. Song, B. Eitzer, S. Majumdar, T. Lapainis, H. Mai, K. Tran, A. El-Demerdash, V. Vega, Y. Cai, J.W. Wong, A.J. Krynitsky, T.H. Begley, A collaborative study: determination of mycotoxins in corn, peanut butter, and wheat flour using stable isotope dilution assay (SIDA) and liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), Journal of Agricultural and Food Chemistry, 65 (33) (2017) 7138-7152. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27983809.