フタル酸エステル類のGC-MS分析: GC液相の特性比較

概要

フタル酸エステル類は環境中の至る所に存在し、ヒトの健康に悪影響をおよぼす可能性があるため注目を集めており、このため検出と分離が必要とされてきました。ガスクロマトグラフィーはフタル酸エステル類の分離に効果的な手法で、電子捕獲検出器 (ECD)、水素炎イオン検出器 (FID)、質量分析計 (MS) を含むいくつかの検出技術と組み合わせることができます。この研究では、Pro EZGCガスクロマトグラフモデリングソフトウェアを使用し、対象化合物のGC-MS分析に最適な液相と分析条件を確定しました。フタル酸エステル類の分離はRtx-440、Rxi-XLB、Rxi-5ms、Rtx-50、Rxi-35Sil MS、Rtx-CLPesticidesおよびRtx-CLPesticides2の7種の異なる液相で比較し、すべての液相において、EPAもしくはEUで規制されている18種のフタル酸エステル類を6分以内で分析できました。さらに37成分のフタル酸エステル類に対象を拡げても、最適化された方法で40分以内に分析され、Rxi-XLB と Restek オリジナルである Rtx-440 の両方で複雑な混合物が最良の分離を示しました。

はじめに

フタル酸エステル類は可塑剤として種々の工業製品に広く使用されていますが、そのうちいくつかは内分泌攪乱物質であると考えられており[1]、先天性欠損症[2]や小児高血圧[3]、妊娠高血圧症候群[4]、呼吸器障害[5]、肥満[6]といった多数の問題と関連付けられています。欧州連合 (EU) や米国環境保護庁 (U.S. EPA) は最も毒性の高いフタル酸エステル類の使用を制限しています (表 I)。

GC-MSはシンプルで迅速、安価であるため、フタル酸エステル類の分析に一般的に使用されている技術です。GC-MSではマススペクトルの情報も得られるため、測定のための強力な分析機器ですが、フタル酸エステル類の構造類似性はMSでの定性・定量分析を困難にすることがあるため、良好なクロマトグラフィー分離が行えるGCカラムを使用することは重要です。たとえばフタル酸エステル類の多くは共通のベースピークイオン (m/z 149) を有しているため、共溶出するフタル酸エステルの同定や定量は困難です。混合物である工業用グレードや異性体は問題をさらに複雑にします。

最近発表された報告ではフタル酸エステル類の分析に最も採用されているGCとLCカラムについてまとめられています。[7]文献によると、フタル酸エステル類の定量ではGC-MSはLC-MSと比較してより良好なクロマトグラフィー分離が得られます。一般的に使用されているGCカラムは、よく使用されている順に5系、XLB系、35系、17系、50系、1系です。各液相で得られる分離は機器の条件を調整することで改善することができますが、これを実際に検討すると長時間を要するおそれがあります。Pro EZGCモデリングソフトウェアは、特定の固定相において分析時間を最短とするために、GCパラメーター(キャリアガスの種類、流量、昇温プログラム、カラムサイズやガードカラムなど)を迅速に最適化することができます。この研究では、7種の液相(Rtx-440、Rxi-XLB、Rxi-5ms、Rtx-50、Rxi-35Sil MS、Rtx-CLPesticides、Rtx-CLPesticides2)について、37成分のフタル酸エステル類(表II)のライブラリがPro EZGCに組み込まれました。またこれらの液相で、規制あり、規制なし両方のフタル酸エステル類の分析を評価しました。

試薬

RestekのEPA Method 8061Aフタル酸エステル混合溶液 (cat.# 33227) は15種類の分析対象化合物を各1,000 µg/mLの濃度で含んでおり、一次標準試薬として使用しました。安息香酸ベンジル(cat.# 31847)を内部標準として使用しました。そのほかのフタル酸エステル類はすべてChem Serviceから購入しました。

装置

GC-MS分析には島津製作所社製QP2010 Plus GC-MSを使用しました。装置には7種類のRestekGCカラム(カラムサイズ30 m x 0.25 mm x 0.25 µm、Rtx-CLPesticides2のみ膜厚0.2 µm)のうち1本を取り付けました。WindowsベースのPro EZGCソフトウェアを使用し、それぞれのカラムについて最適な条件を決定し、その後、全体の分離が最良となった条件に統一してサンプルを分析することで、すべてのカラムを直接比較しました。この直接比較ではカラム間の選択性の違いをよく理解することができます。カラムの詳細説明とGC-MS実験パラメーターは 表I と 表III にそれぞれ示されています。 

サンプル前処理

標準試薬を溶解しジクロロメタンで希釈しました。標準溶液は50 µg/mL(内部標準である安息香酸ベンジルは 80 µg/mL )に調製しました。サンプル調製において、プラスチックの使用は完全に避け、すべての調製作業にはガラス器具(メスフラスコ、シリンジ、バイアルなど)を使用しました。

結果と考察

EPAならびにEUで規制されているフタル酸エステル類の分離についてカラム性能の直接比較を行いました。7種の異なる液相におけるフタル酸エステルの保持時間は同じGC条件のもとPro EZGCによって予測しました。 表 I に示されているこれらの条件は、それぞれのカラム用に最適化された中で、全体的に最良のクロマトグラムが得られる条件でした。共溶出は分離度が1.5未満の隣り合って溶出するピークであると定義づけました。トータルの分析時間は6分未満でした。Pro EZGCが予測した保持時間を確認するために、ソフトウェアで使用した同じ条件下での各液相のクロマトグラムを示しました(図1)。 カラムの長さはシミュレーションのように30 mきっかりではないため、絶対保持時間は予測した値から少しずれました。しかしながら溶出順と共溶出するピークの組み合わせは予測と一致しています。Rtx-440、Rtx-XLB、Rtx-CLPesticides、 Rxi-35Sil MSの各カラムではEPAならびにEUで規制されているフタル酸エステル類すべてについてベースライン分離を達成しました。bis[4-methyl-2-pentyl]phthalateの2つの異性体は7種の液相のいずれにおいても分離しませんでした。溶出順は Rtx-440、Rtx-XLB、Rtx-CLPesticides、Rxi-5msの各カラムで同じでした。

表 I: Restek GCカラムにおける規制対象フタル酸エステル類の予測保持時間

カラム: 30 m x 0.25 mm x 0.25 μm (0.20 μm for Rtx-CLPesticides2 column)
定線速度: 66.7 cm/sec
オーブン: 200 °C (hold 0.5 min) to 330 °C (320 °C for Rtx-50 column) at 30 °C/min (hold 1 min)

Note: 色つきセルは共溶出ピークを示しています (Rs<1.5)。 それぞれのカラムについて、色の違うセルは異なる共溶出対を示しています。
*これらの化合物はRestekのEPA Method 8061A phthalates esters mixture (cat.# 33227)に含まれています。
**ピーク19と20はアイソバリック化合物ではないので、SIMモードで分離が可能です。

溶出順の違いはRxi-35Sil MSとRtx-50で見られました。特にRxi-35Sil MSでは、bis(2-methoxyethyl) phthalateとbis(4-methyl-2-pentyl) phthalate異性体(ピーク6と7/8)、bis(2-ethoxyethyl) phthalateとdi-n-pentyl phthalate(ピーク9と10)、butyl benzyl phthalate とhexyl-2-ethylhexyl phthalate (ピーク12と13)、 bis(2-butoxyethyl) phthalate と bis(2-ethylhexyl) phthalate (ピーク14と15) を含む4対のフタル酸エステル類 の溶出順が変わっています。

Rtx-440とRxi-XLBではこれらの条件下で全体的に最良の分離が得られました。他の液相では共溶出したピークはRtx-440とRxi-XLBで分離が改善しています。他の液相で分離されなかったピークには次の組み合わせが含まれています。Rxi-5msカラムでのbis(2-ethylhexyl) phthalateとdicyclohexyl phthalate (ピーク15と16)； Rtx-50でのbis(2-ethylhexyl) phthalateとbutyl benzyl phthalate (ピーク 15 と 12)； Rtx-CLPesticides2でのbis(2-methoxyethyl) と bis[4-methyl-2-pentyl] phthalate (ピーク6 と 7、8) およびbis(2-ethoxyethyl) phthalateとdi-n-pentyl phthalate (ピーク9と10)。工業用グレードの異性体混合物ではdiisononyl phthalateやdiisodecyl phthalate (ピーク18と19)のような異性体グループを特定することはできますが、グループ内の個々の異性体を完全分離することはできません。幸いなことに、diisononyl phthalateであれば m/z 293、diisodecyl phthalateであれば m/z 307のような (図1)固有のフラグメントイオンを定性や定量に利用することができます。

Pro EZGCで予測された保持時間を使い、7種の液相を用いて、フタル酸エステル37成分 (3つの異性体を含むため、総ピーク数は40) の分離をより総合的に比較しました (表 II)。表 III に示されたGCパラメータは Rtx-440とRxi-XLB 両方で40分未満で40ピークのうち34ピークの分離が得られ、共溶出する化合物は2つの液相で異なりました。Rtx-440カラムのクロマトグラムは図2にまとめて示されています。ベースライン分離されていないいくつかのピークについては、定性分析であれば充分な分離能です。すべての液相に共通する最適な分析条件はありません。分析時間とピークの分離の全体的な結果からカラムの直接比較のためのプログラムを選びました。分析担当者はPro EZGCを使用して特定の対象リストのために分析条件を最適化することができます。全体の分析のスピードと分析対象物の分離度に基づくと、フタル酸エステル類のGC-MS分析にRtx-440とRxi-XLBをおすすめいたします。

表 II: Restek GCカラムにおけるフタル酸エステル類の予測保持時間（規制対象外の追加含む）

カラム: 30 m x 0.25 mm x 0.25 μm (0.20 μm for Rtx-CLPesticides2 column)
定線速度: 48 cm/sec
オーブン: 150 °C (hold 0.8 min) to 200 °C at 5 °C/min to 275 °C at 3 °C/min (hold 2 min)

Note: 色つきセルは共溶出ピークを示しています (Rs<1.5)。 それぞれのカラムについて、色の違うセルは異なる共溶出対を示しています。
*これらの化合物はRestekのEPA Method 8061A phthalates esters mixture (cat.# 33227)に含まれています。

表 III: GC-MS パラメータ

*320 °C for Rtx-50 column
**3 mL/min may be too high for some instruments. Consult your instrument operations manual prior to programming.

GC-MSはより確定的な情報が得られるため一般的に採用されていますが、フタル酸エステル類の分析はGC-ECDでも良好に達成されます。EPA 8061Aは並列カラムと2台の電子捕獲型検出器を使用した水中ならびに固体マトリクス中のフタル酸エステル類の定性・定量法です[8]。Rtx-440とRxi-35Sil MSカラムは2本の並列デュアルカラムとして理想的です。Pro EZGCはRtx-440を使用した高速分析条件を提案し、前述の溶出順の違いによりRxi-35Sil MSは優れた確認カラムとして有用でした。GC-ECD条件は、フリーオンラインソフトPro EZGCメソッドトランスレーターを使用し表IIIに示したGC-MS条件から簡単に変換できます。

まとめ

GCの最適化を柔軟にまた容易にするPro EZGCを使用して、フタル酸エステル類の分析によく使用される7種類のGCカラムを直接比較しました。Rtx-440とRxi-XLBの優れた選択性と高い効率により、規制対象のフタル酸エステル類と拡張した化合物群の両方について分析時間を短縮することができました。良好な分離、高い最高使用温度(Rtx-440では340°C、Rxi-XLBでは 360 °C [表IV])および最小限のカラムブリードにより、Rtx-440とRxi-XLBはフタル酸エステル類のGC-MS分析に最適な選択肢です。Rtx-440とRxi-35Sil MSの2本のカラムの組み合わせは、GC-MSの代わりにGC-ECDを使用する場合におすすめです。

表 IV: 最高使用温度

謝辞

The authors would like to thank Shimadzu Corporation for their consultation.

参考文献

1.  H. Choi, J. Kim, Y. Im, S. Lee, Y. Kim, The association between some endocrine disruptors and hypospadias in biological samples. J. Environ. Sci. Health, Part A: Toxic/Hazard. Subst. Environ. Eng. 47 (13) (2012) 2173–2179. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22871016
2. N. Nassar, P. Abeywardana, A. Barker, C. Bower, Parental occupational exposure to potential endocrine disrupting chemicals and risk of hypospadias in infants. Occup. Environ. Med. 67 (9) (2010) 585–589. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19939854
3. L. Trasande, S. Sathyanarayana, A.J. Spanier, H. Trachtman, T.M. Attina, E.M. Urbina, Urinary phthalates are associated with higher blood pressure in childhood. J. Pediatr. 163 (3) (2013) 747–753e1. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4074773/
4. E.F. Werner, J.M. Braun, K. Yolton, J.C. Khoury, B.P. Lanphear, The association between maternal urinary phthalate concentrations and blood pressure in pregnancy: The HOME Study. Environ. Health 14 (2015) 75. http://www.ehjournal.net/content/14/1/75
5. J.J. Jaakkola, T.L. Knight, The role of exposure to phthalates from polyvinyl chloride products in the development of asthma and allergies: A systematic review and meta-analysis. Environ. Health Perspect. 116 (7) (2008) 845–853.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2453150/
6. E.E. Hatch, J.W. Nelson, R.W. Stahlhut, T.F. Webster, Association of endocrine disruptors and obesity: Perspectives from epidemiological studies. Int. J. Androl. 33 (2) (2010) 324–332. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20113374
7. S. Net, A. Delmont, R. Sempere, A. Paluselli, B. Ouddane, Reliable quantification of phthalates in environmental matrices (air, water, sludge, sediment and soil): A review. Sci. Total Environ. 515-516 (2015) 162–180. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25723871
8. U.S. Environmental Protection Agency, Method 8061A, Phthalate Esters by Gas Chromatography with Electron Capture Detection (GC/ECD), Rev. 1, December 1996. https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-12/documents/8061a.pdf

Rtx-440

	Peaks
1.	Dimethyl phthalate
2.	Diethyl phthalate
3.	Benzyl benzoate
4.	Diisobutyl phthalate
5.	Di-n-butyl phthalate
6.	Bis(2-methoxyethyl) phthalate
7.	Bis[4-methyl-2-pentyl] phthalate isomer 1
8.	Bis[4-methyl-2-pentyl] phthalate isomer 2
9.	Bis(2-ethoxyethyl) phthalate
10.	Di-n-pentyl phthalate

	Peaks
11.	Di-n-hexyl phthalate
12.	Butyl benzyl phthalate
13.	Hexyl-2-ethylhexyl phthalate
14.	Bis(2-butoxyethyl) phthalate
15.	Bis(2-ethylhexyl) phthalate
16.	Dicyclohexyl phthalate
17.	Di-n-octyl phthalate
18.	Diisononyl phthalate
19.	Diisodecyl phthalate
20.	Dinonyl phthalate

Column	Rtx-440, 30 m, 0.25 mm ID, 0.25 µm (cat.# 12923)
Standard/Sample
	Benzyl benzoate (cat.# 31847)
	EPA Method 8061A phthalate esters mixture (cat.# 33227)
	Diisononyl phthalate
	Diisodecyl phthalate
	Hexyl-2-ethylhexyl phthalate
Diluent:	Methylene chloride
Conc.:	50.0 µg/mL (80 μg/mL for internal standard benzyl benzoate)
Injection
Inj. Vol.:	1 µL split (split ratio 20:1)
Liner:	Premium 3.5 mm Precision liner w/wool (cat.# 23320)
Inj. Temp.:	280 °C
Split Vent Flow Rate:	3 mL/min
Oven
Oven Temp.:	200 °C (hold 0.5 min) to 330 °C at 30 °C/min (hold 1 min)
Carrier Gas	He, constant linear velocity
Linear Velocity:	66.7 cm/sec, 39.5 psi, 272.3 kPa @ 200 °C

Detector	MS
Mode:	Scan
Scan Program:
Group Start Time (min) Scan Range (amu) Scan Rate (scans/sec) 1 0.9 59-400 -
Transfer Line Temp.:	300 °C
Analyzer Type:	Quadrupole
Source Temp.:	280 °C
Electron Energy:	70 eV
Solvent Delay Time:	0.9 min
Tune Type:	PFTBA
Ionization Mode:	EI
Instrument	Shimadzu 2010 GC & QP2010+ MS
Notes	The constant linear velocity of 66.7 cm/sec is equal to 3 mL/min @ 200 °C. The MS scan interval is 0.1 sec.
Acknowledgement	The authors would like to thank Shimadzu Corporation for their consultation with the operation of the QP2010 Plus GC-MS instrument.

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Rxi-XLB

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Rtx-CLPesticides

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Rxi-35Sil MS

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Rtx-50

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Rxi-5ms

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Rtx-CLPesticides2

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	Peaks
1.	Dimethyl phthalate
2.	Dimethyl isophthalate
3.	Diethyl phthalate
4.	Benzyl benzoate
5.	Diisobutyl phthalate
6.	Di-n-butyl phthalate
7.	Bis(2-methoxyethyl) phthalate
8.	Bis[4-methyl-2-pentyl] phthalate isomer 1
9.	Bis[4-methyl-2-pentyl] phthalate isomer 2
10.	Bis(2-ethoxyethyl) phthalate
11.	Di-n-pentyl phthalate
12.	Butyl cyclohexyl phthalate
13.	Butyl 2-ethylhexyl phthalate

	Peaks
14.	Di-n-hexyl phthalate
15.	Butyl octyl phthalate
16.	Butyl benzyl phthalate
17.	Hexyl-2-ethylhexyl phthalate
18.	Butyl isodecyl phthalate
19.	Bis(2-ethylhexyl)hexahydro phthalate
20.	Bis(2-n-butoxyethyl) phthalate
21.	Dicyclohexyl phthalate
22.	Bis(2-ethylhexyl) phthalate
23.	Butyl-n-decyl phthalate
24.	Diphenyl phthalate
25.	Bis(4-methylcyclohexyl) phthalate isomer 1
26.	Bis(4-methylcyclohexyl) phthalate isomer 2

	Peaks
27.	Hexyl isodecyl phthalate
28.	Benzyl 2-ethylhexyl phthalate
29.	Bis(4-methylcyclohexyl) phthalate isomer 3
30.	Bis(2-ethylhexyl) isophthalate
31.	Bis(2-(ethoxyethoxy)ethyl) phthalate
32.	Di-n-octyl phthalate
33.	n-Hexyl decyl phthalate
34.	Diphenyl isophthalate
35.	Dibenzyl phthalate
36.	Diisononyl phthalate
37.	Di-n-octyl isophthalate
38.	Diisodecyl phthalate
39.	Dinonyl phthalate
40.	n-Octyl n-decyl phthalate

Column	Rtx-440, 30 m, 0.25 mm ID, 0.25 µm (cat.# 12923)
Standard/Sample
	Phthalate standards mixture
	Benzyl benzoate (cat.# 31847)
Diluent:	Methylene chloride
Conc.:	50 µg/mL (80 μg/mL for internal standard benzyl benzoate)
Injection
Inj. Vol.:	1 µL split (split ratio 20:1)
Liner:	Premium 3.5 mm Precision liner w/wool (cat.# 23320)
Inj. Temp.:	280 °C
Split Vent Flow Rate:	3 mL/min
Oven
Oven Temp.:	150 °C (hold 0.8 min) to 200 °C at 5 °C/min to 275 °C at 3 °C/min (hold 2 min)
Carrier Gas	He, constant linear velocity
Linear Velocity:	48 cm/sec, 21.4 psi, 147.5 kPa @ 150 °C

Detector	MS
Mode:	Scan
Scan Program:
Group Start Time (min) Scan Range (amu) Scan Rate (scans/sec) 1 2.5 59-400 -
Transfer Line Temp.:	300 °C
Analyzer Type:	Quadrupole
Source Temp.:	280 °C
Electron Energy:	70 eV
Solvent Delay Time:	2.5 min
Tune Type:	PFTBA
Ionization Mode:	EI
Instrument	Shimadzu 2010 GC & QP2010+ MS
Notes	The constant linear velocity of 48 cm/sec is equivalent to approximately 1.61 mL/min at 150 °C. The MS scan interval is 0.1 sec.
Acknowledgement	The authors would like to thank Shimadzu Corporation for their consultation with the operation of the QP2010 Plus GC-MS instrument.

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