L’analisi di pesticidi e micotossine nei brownie alla cannabis
Abstract
I regolamenti governativi della California impongono all’industria della cannabis di sottoporre i prodotti alimentari all’analisi di una lunga lista di pesticidi e micotossine. Nel presente studio è stato sviluppato un flusso di lavoro efficace per eseguire questa analisi complessa sui brownie, e vengono illustrate in dettaglio alcune strategie di ottimizzazione volte a fornire un punto di partenza per matrici simili. Sono stati impiegati i metodi LC-MS/MS e GC-MS/MS e per tutti i composti target sono stati raggiunti eccellenti risultati a livello di LOQ, linearità, accuratezza e precisione.
Introduzione
La legalizzazione della cannabis (marijuana) per scopi ricreativi e medici richiede metodi analitici accurati e affidabili per valutare la qualità e la sicurezza di qualsiasi prodotto derivato dalla cannabis. Per sviluppare metodi efficaci occorre considerare attentamente le proprietà degli analiti e gli effetti della matrice, e le analisi sono ulteriormente complicate dal fatto che i requisiti variano a seconda del Paese e dei diversi tipi di prodotto. Tra i numerosi prodotti a base di cannabis disponibili in commercio, quelli commestibili rappresentano una delle categorie più diffuse e comprendono un'ampia varietà di prodotti, quali diversi tipi di bevande, cioccolatini, prodotti da forno e caramelle, solo per citarne alcuni. Attualmente lo stato della California richiede l’analisi di una lunga lista di pesticidi e micotossine non solo nel fiore di cannabis, ma anche nei prodotti derivati da questa pianta [1]. Per questa ragione, è fondamentale elaborare metodi in grado di affrontare le sfide poste dai diversi tipi di matrice.
Questo articolo descrive lo sviluppo di un metodo di test per l'analisi di pesticidi e micotossine nei brownie alla cannabis in base alla lista stilata dal governo californiano. Abbiamo scelto i brownie come matrice modello in quanto sono molto diffusi tra i consumatori di prodotti alimentari a base di cannabis, ma anche perché contengono livelli elevati di potenziali interferenze (carboidrati e grassi). Illustreremo il lavoro di sviluppo che abbiamo dovuto effettuare per ottimizzare il metodo per l’analisi dei brownie, che proponiamo come punto di riferimento per laboratori che sviluppano metodi per prodotti alimentari simili (per esempio, biscotti o altri prodotti da forno). Il metodo finale qui stabilito per l’analisi di pesticidi e micotossine nei brownie alla cannabis ha fornito risultati eccellenti in termini di linearità, accuratezza, precisione e limiti di quantificazione (limit of quantification, LOQ).
Studio sperimentale
Inizialmente è stato eseguito un lavoro di sviluppo del metodo per ottimizzare la procedura di preparazione dei campioni e per valutare l’impatto degli effetti della matrice sull’analisi quantitativa. L'esito di tali esperimenti viene discusso nella sezione dedicata ai risultati, e viene qui presentata la metodologia finale raccomandata per l’analisi di pesticidi e micotossine nei brownie alla cannabis.
Preparazione del campione
Per un campione solido come i brownie, la prima fase della preparazione del campione è l’omogeneizzazione della matrice. Per ridurre il campione in polvere molto fine abbiamo utilizzato un mulino SPEX Freezer/Mill. I campioni sono stati preraffreddati per 2 minuti, e dopo tre cicli da 2 minuti ciascuno di triturazione (a 15 cps) e 1 minuto di raffreddamento è stata ottenuta una polvere sfusa e omogenea facile da lavorare. (In alternativa si potrebbe utilizzare un robot da cucina con ghiaccio secco).
Per il bianco è stata pesata una matrice di brownie polverizzata (0,5 g) in un vial di vetro da 4,0 mL (cat.# 24654) e fortificata con pesticidi e micotossine ai livelli definiti nella Tabella I. Una miscela di standard interni è stata aggiunta a 200 ng/g (composti elencati nella Tabella II). 1,5 mL di acetonitrile acidificato con 1% di acido acetico è stato aggiunto al campione. Il campione è stato vortexato e sonicato per 5 minuti (non è stata necessaria la centrifuga), quindi il surnatante è stato fatto passare attraverso una cartuccia SPE Resprep C18 da 100 mg (cat.# 26030). Al pellet del campione sono stati aggiunti ulteriori 1,5 mL di solvente di estrazione (acetonitrile acidificato) e poi il campione è stato vortexato di nuovo. Il surnatante è stato fatto passare attraverso la stessa cartuccia C18.
Per l'analisi LC-MS/MS, 750 µL di surnatante sono stati miscelati a 250 µL di acqua e il tutto è stato poi centrifugato per 5 minuti a bassa temperatura (~7 ⁰C). Un’aliquota di 2 μL di estratto finale è stata iniettata nel sistema LC-MS/MS.
Per l’analisi GC-MS/MS, il surnatante rimanente è stato trasferito in una provetta Q-sep QuEChERS dSPE contenente solfato di magnesio e PSA pre-pesati (cat.# 26215). Dopo il passaggio al vortex e la centrifuga, 500 μL di estratti sono stati miscelati a 500 μL di acetonitrile acidificato. Un’aliquota di 1 μL di estratto finale è stata iniettata nel sistema GC-MS/MS.
Standard di calibrazione e campioni di controllo qualità (QC)
Una curva di calibrazione a nove punti con un range compreso tra 5 e 700 ng/g è stata preparata in triplicato nella matrice per valutare la linearità e consentire l’analisi quantitativa. Per valutare l'accuratezza e la precisione del metodo, sono stati preparati in quadruplicato tre diversi livelli di concentrazione QC (10, 100, e 500 ng/g). Sia per gli standard di calibrazione che per i campioni QC, per il bianco sono stati pesati 0,5 g di matrice di brownie polverizzata in un vial di vetro da 4 mL. Nella Tabella I sono riportati i µL di soluzione madre aggiunti a ogni vial per ottenere concentrazioni diverse nella matrice.
Tabella I: Preparazione dello standard di calibrazione e livelli di concentrazione dei campioni QC.
Description | Concentration in Matrix (ng/g) |
Volume of Fortification Solution Added (µL) |
Concentration of Fortification Solution (ng/mL) |
---|---|---|---|
Calibration 1 | 5 | 10 | 250 |
QC Low | 10 | 20 | 250 |
Calibration 2 | 25 | 50 | 250 |
Calibration 3 | 50 | 25 | 1000 |
Calibration 4 | 75 | 37.5 | 1000 |
QC Medium | 100 | 50 | 1000 |
Calibration 5 | 150 | 15 | 5000 |
Calibration 6 | 200 | 20 | 5000 |
Calibration 7 | 300 | 30 | 5000 |
Calibration 8 | 400 | 40 | 5000 |
QC High | 500 | 50 | 5000 |
Calibration 9 | 700 | 70 | 5000 |
Compound | Type | ISTD Group |
Daminozide-D6 | ISTD | 8 |
Daminozide | Target | 8 |
Acephate | Target | 3 |
Oxamyl | Target | 2 |
Flonicamid | Target | 3 |
Methomyl | Target | 2 |
Thiamethoxam | Target | 2 |
Imidacloprid | Target | 2 |
Mevinphos I | Target | 2 |
Mevinphos II | Target | 2 |
Acetamiprid | Target | 1 |
Dimethoathe-D6 | ISTD | 3 |
Dimethoate | Target | 3 |
Thiacloprid | Target | 1 |
Aldicarb | Target | 2 |
Dichlorvos | Target | 4 |
Dichlorvos-D6 | ISTD | 4 |
Imazalil | Target | 1 |
Carbofuran | Target | 1 |
Propoxur | Target | 1 |
Carbaryl-D7 | ISTD | 5 |
Carbaryl | Target | 5 |
Diuron-D6 | ISTD | 2 |
Atrazine-D5 | ISTD | 7 |
Naled | Target | 2 |
Metalaxyl | Target | 2 |
Spiroxamin | Target | 1 |
Chlorantraniliprole | Target | 2 |
Phosmet | Target | 1 |
Azoxystrobin | Target | 2 |
Linuron-D6 | ISTD | 1 |
Fludioxonil | Target | 1 |
Methiocarb | Target | 2 |
Boscalid | Target | 1 |
Dimethomorph I | Target | 2 |
Paclobutrazol | Target | 1 |
Dimethomorph II | Target | 2 |
Malathion | Target | 1 |
Myclobutanil | Target | 1 |
Bifenazate | Target | 1 |
Fenhexamid | Target | 1 |
Spirotetramat | Target | 1 |
Fipronil | Target | 1 |
Ethoprophos | Target | 1 |
Fenoxycarb | Target | 1 |
Kresoxim methyl | Target | 6 |
Tebuconazole | Target | 1 |
Diazinon-D10 | ISTD | 6 |
Diazinon | Target | 6 |
Spinosad A | Target | 6 |
Pyridaben | Target | 6 |
Coumaphos | Target | 6 |
Propiconazole | Target | 1 |
Clofentezine | Target | 1 |
Spinosad (Spinosyn D) | Target | 6 |
Spinetoram (Spinosyn J) | Target | 6 |
Prallethrin | Target | 1 |
Trifloxystrobin | Target | 6 |
Pyrethrin II | Target | 6 |
Spinetoram (Spinosyn L) | Target | 6 |
Piperonyl butoxide | Target | 1 |
Chlorpyrifos | Target | 1 |
Hexythiazox | Target | 1 |
Etoxazole | Target | 6 |
Spiromesifen | Target | 6 |
Pyrethrin I | Target | 1 |
Cyfluthrin | Target | 1 |
Fenpyroximate | Target | 6 |
Cypermethrin | Target | 2 |
Abamectine | Target | 6 |
Permethrin-trans | Target | 6 |
Permethrin-cis | Target | 6 |
Etofenprox | Target | 6 |
Bifenthrin | Target | 2 |
Acequinocyl 343 | Target | 6 |
Acequinocyl 402 | Target | 6 |
Aflatoxin G2 | Target | 1 |
Aflatoxin G1 | Target | 1 |
Aflatoxin B2 | Target | 1 |
Ochratoxin A | Target | 1 |
Aflatoxin B1 | Target | 1 |
Parametri dello strumento
L’analisi LC-MS/MS di pesticidi e micotossine nei brownie alla cannabis è stata effettuata utilizzando una colonna analitica Raptor ARC-18 da 2,7 µm x 100 mm x 2,1 mm (cat.# 9314A12) e uno Shimadzu LCMS-8060 LC-MS/MS. I parametri generali dello strumento, la polarità ESI di ciascun composto e le transizioni degli analiti sono riportati nella Figura 1.
L’analisi GC-MS/MS è stata effettuata utilizzando una colonna analitica Rxi-5ms (cat.# 13423) da 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm e un Thermo Scientific TSQ 8000 Triple Quadrupole GC-MS/MS. I parametri dello strumento e le transizioni degli analiti sono riportati nella Figura 2. Si noti che per questa applicazione è stato importante utilizzare un liner a cono singolo con lana (cat.# 23447). L’impaccamento in lana aumenta la vaporizzazione e la miscelazione/omogeneizzazione con il carrier gas per una migliore riproducibilità, e il cono nella parte inferiore del liner incanala gli analiti nella colonna, riducendo le potenziali interazioni con la guarnizione dell’iniettore. Inoltre, è stato impiegato un tempo di mantenimento di 10 min alla fine di ciascuna corsa per evitare il carry over dei composti e interferenze con le analisi successive.
Risultati e discussione
Prestazione cromatograficaPer coprire tutti i composti regolati dallo stato di California abbiamo sviluppato i metodi LC-MS/MS e GC-MS/MS. Sebbene sia facile analizzare la maggioranza dei pesticidi utilizzando il metodo LC-MS/MS, i pesticidi idrofobici, quali il chlordane, il methyl parathion, il captan, il chlorfenapyr, e il pentachloronitrobenzene (PCNB), non possono essere rilevati o sono scarsamente ionizzati in condizioni di ionizzazione elettrospray. Altri pesticidi, come il cyfluthrin e la cypermethrin, hanno invece una scarsa risposta in modalità ESI, ma possono essere analizzati sia il metodo strumentale GC-MS/MS che LC-MS/MS Al fine di ottenere una risposta ESI accettabile per questi due analiti, le temperature della sorgente di ionizzazione dovrebbero essere impostate su valori relativi bassi. Nel nostro caso, le temperature dell’interfaccia, della linea di desolvatazione e del blocco riscaldante sono state tutte impostate a 100 °C. In questo studio, chlordane, methyl parathion, captan, chlorfenapyr, and pentachloronitrobenzene (PCNB) sono stati analizzati utilizzando GC-MS/MS; mentre cyfluthrin e cypermethrin sono stati analizzati utilizzando entrambi gli strumenti, e il resto dei pesticidi e delle micotossine è stato analizzato utilizzando solo il metodo LC-MS/MS. Le Figure 1 e 2 mostrano rispettivamente i cromatogrammi LC e GC per gli analiti target. Uno dei principali vantaggi delle nostre condizioni di gradiente LC è che tutte le micotossine eluiscono in 2,4 - 3,6 minuti, mentre i principali cannabinoidi, quali CBD, CBG, CBN, THC, e THCA-A, cominciano a eluire dopo 5,6 minuti. In base a un confronto con uno standard misto di cannabinoidi analizzati alle stesse condizioni impiegate qui, le uniche coeluizioni tra gli analiti target e i principali cannabinoidi sarebbero tra CBD e piperonyl butoxide (5.7 min), CBG e chlorpyrifos (5.8), e cyfluthrin e CBN (6.5 min). In nessun composto target ci sono state coeluizioni tra THC (delta 8 e 9) e THCA-A.
Figura 1: Analisi LC-MS/MS di pesticidi e micotossine nei brownie alla cannabis.

Peaks | tR (min) | Precursor Ion | Product Ion 1 | Product Ion 2 | Polarity | |
---|---|---|---|---|---|---|
1. | Daminozide-d6 | 0.6 | 167.0 | 149.3 | 49.3 | + |
2. | Daminozide | 0.7 | 161.1 | 44.1 | 143.2 | + |
3. | Acephate | 1.5 | 184.0 | 143.1 | 95.1 | + |
4. | Oxamyl | 1.8 | 237.1 | 72.1 | 90.1 | + |
5. | Flonicamid | 1.9 | 230.1 | 203.1 | 174.1 | + |
6. | Methomyl | 1.9 | 163.1 | 88.1 | 106.1 | + |
7. | Thiamethoxam | 1.9 | 292.0 | 211.1 | 181.1 | + |
8. | Imidacloprid | 2.2 | 256.1 | 209.1 | 175.1 | + |
9. | Mevinphos I | 2.2 | 225.1 | 127.1 | 193.2 | + |
10. | Acetamiprid | 2.2 | 223.0 | 126.1 | 56.1 | + |
11. | Dimethoathe-d6 | 2.2 | 236.1 | 205.1 | - | + |
12. | Dimethoate | 2.3 | 230.0 | 199.1 | 125.1 | + |
13. | Thiacloprid | 2.4 | 253.0 | 126.0 | 90.1 | + |
14. | Mevinphos II | 2.4 | 225.1 | 127.1 | 193.2 | + |
15. | Aflatoxin G2 | 2.4 | 331.2 | 189.3 | 115.2 | + |
16. | Aflatoxin G1 | 2.4 | 329.2 | 243.2 | 215.3 | + |
17. | Aldicarb | 2.5 | 116.0 | 89.2 | 70.2 | + |
18. | Aflatoxin B2 | 2.5 | 315.3 | 287.2 | 243.3 | + |
19. | Dichlorvos | 2.6 | 220.9 | 109.1 | 79.2 | + |
20. | Dichlorvos-d6 | 2.6 | 227.0 | 115.1 | - | + |
21. | Aflatoxin B1 | 2.6 | 313.2 | 241.2 | 128.2 | + |
22. | Imazalil | 2.6 | 297.0 | 159.0 | 201.0 | + |
23. | Carbofuran | 2.6 | 222.1 | 123.1 | 165.2 | + |
24. | Propoxur | 2.6 | 210.1 | 111.1 | 93.1 | + |
25. | Carbaryl-d7 | 2.7 | 209.2 | 152.2 | - | + |
26. | Carbaryl | 2.7 | 202.1 | 145.1 | 127.1 | + |
27. | Diuron-d6 | 2.9 | 239.1 | 78.2 | - | + |
28. | Atrazine-d5 | 2.9 | 221.2 | 179.1 | - | + |
29. | Naled | 2.9 | 397.8 | 127.1 | 109.1 | + |
30. | Metalaxyl | 2.9 | 280.2 | 220.2 | 192.2 | + |
31. | Spiroxamine | 2.9 | 298.3 | 144.2 | 100.2 | + |
32. | Chlorantraniliprole | 3.0 | 483.9 | 452.9 | 285.9 | + |
33. | Phosmet | 3.0 | 318.0 | 160.1 | 77.2 | + |
34. | Azoxystrobin | 3.1 | 404.0 | 372.1 | 344.1 | + |
35. | Linuron-d6 | 3.1 | 255.1 | 160.1 | - | + |
36. | Fludioxonil | 3.2 | 247.0 | 180.0 | 126.0 | - |
37. | Methiocarb | 3.2 | 226.1 | 169.1 | 121.1 | + |
38. | Dimethomorph I | 3.2 | 388.2 | 301.2 | 165.3 | + |
39. | Boscalid | 3.2 | 342.9 | 307.1 | 140.1 | + |
40. | Paclobutrazol | 3.3 | 294.3 | 70.1 | 125.1 | + |
41. | Malathion | 3.3 | 331.0 | 127.2 | 285.2 | + |
42. | Dimethomorph II | 3.4 | 388.2 | 301.2 | 165.3 | + |
43. | Myclobutanil | 3.4 | 289.1 | 70.1 | 125.1 | + |
44. | Bifenazate | 3.4 | 301.0 | 198.1 | 170.2 | + |
45. | Ochratoxin A | 3.5 | 404.2 | 239.1 | 358.3 | + |
46. | Fenhexamid | 3.5 | 302.1 | 97.1 | 55.2 | + |
47. | Spirotetramat | 3.7 | 374.2 | 302.1 | 216.1 | + |
48. | Ethoprophos | 3.8 | 243.1 | 131.1 | 97.1 | + |
49. | Fipronil | 3.8 | 436.8 | 331.8 | 251.9 | - |
50. | Fenoxycarb | 3.9 | 302.1 | 88.1 | 116.1 | + |
51. | Kresoxim-methyl | 4.1 | 314.2 | 267.2 | 222.2 | + |
52. | Tebuconazole | 4.2 | 308.1 | 70.1 | 125.1 | + |
53. | Diazinon-d10 | 4.2 | 315.2 | 170.2 | - | + |
54. | Spinosyn A (spinosad) | 4.3 | 732.4 | 142.2 | 98.1 | + |
55. | Diazinon | 4.3 | 305.1 | 169.2 | 153.2 | + |
56. | Coumaphos | 4.4 | 363.1 | 227.1 | 307.1 | + |
57. | Pyridaben | 4.4 | 365.1 | 309.2 | 147.2 | + |
58. | Propiconazole | 4.4 | 342.0 | 159.0 | 69.2 | + |
59. | Clofentezine | 4.5 | 303.0 | 138.1 | 102.1 | + |
60. | Spinosyn D (spinosad) | 4.8 | 746.5 | 142.3 | 98.4 | + |
61. | Spinosyn J (spinetoram) | 4.8 | 748.5 | 142.3 | 98.3 | + |
62. | Trifloxystrobin | 4.9 | 409.2 | 186.1 | 145.1 | + |
63. | Prallethrin | 4.9 | 301.2 | 123.2 | 105.2 | + |
64. | Pyrethrin II | 5.2 | 373.1 | 161.1 | 133.2 | + |
65. | Spinosyn L (spinetoram) | 5.4 | 760.5 | 142.2 | 98.1 | + |
66. | Piperonyl butoxide | 5.7 | 356.3 | 177.2 | 119.2 | + |
67. | Chlorpyrifos | 5.8 | 349.9 | 198.0 | 97.1 | + |
68. | Hexythiazox | 5.9 | 353.1 | 228.1 | 168.1 | + |
69. | Etoxazole | 6.4 | 360.2 | 141.1 | 304.2 | + |
70. | Spiromesifen | 6.4 | 273.2 | 255.2 | 187.2 | + |
71. | Pyrethrin I | 6.6 | 329.2 | 161.2 | 105.2 | + |
72. | Cyfluthrin (qualifier) | 6.6 | 453.1 | 193.2 | - | + |
73. | Cyfluthrin | 6.6 | 451.1 | 191.2 | - | + |
74. | Cypermethrin | 6.8 | 433.1 | 191.0 | 416.0 | + |
75. | (E)-Fenpyroximate | 6.8 | 422.2 | 366.1 | 138.1 | + |
76. | trans-Permethrin | 7.4 | 408.3 | 183.2 | 355.1 | + |
77. | cis-Permethrin | 7.7 | 408.3 | 183.2 | 355.1 | + |
78. | Avermectin B1a | 7.7 | 890.5 | 305.4 | 567.4 | + |
79. | Etofenprox | 7.8 | 394.3 | 177.2 | 359.3 | + |
80. | Bifenthrin | 8.0 | 440.0 | 181.2 | 166.2 | + |
81. | Acequinocyl (precursor ion 1) | 9.3 | 402.3 | 343.2 | 189.0 | + |
82. | Acequinocyl (precursor ion 2) | 9.3 | 386.0 | 344.2 | 189.1 | + |
Column | Raptor ARC-18 (cat.# 9314A12) | ||||||||||||||||||||||||||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Dimensions: | 100 mm x 2.1 mm ID | ||||||||||||||||||||||||||||||||
Particle Size: | 2.7 µm | ||||||||||||||||||||||||||||||||
Pore Size: | 90 Å | ||||||||||||||||||||||||||||||||
Guard Column: | Raptor ARC-18 EXP guard column cartridge 5 mm, 2.1 mm ID, 2.7 µm (cat.# 9314A0252) | ||||||||||||||||||||||||||||||||
Temp.: | 40 °C | ||||||||||||||||||||||||||||||||
Standard/Sample | California pesticide standard #1 (cat.# 34124) | ||||||||||||||||||||||||||||||||
California pesticide standard #2 (cat.# 34125) | |||||||||||||||||||||||||||||||||
California pesticide standard #3 (cat.# 34126) | |||||||||||||||||||||||||||||||||
California pesticide standard #4 (cat.# 34127) | |||||||||||||||||||||||||||||||||
California pesticide standard #5 (cat.# 34128) | |||||||||||||||||||||||||||||||||
California pesticide standard #6 (cat.# 34129) | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Dimethoate-d6 (cat.# 31988) | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Dichlorvos-d6 (cat.# 31987) | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Carbaryl-d7 (cat.# 31985) | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Diazinon-d10 (cat.# 31986) | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Atrazine-d5 (cat.# 31984) | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Diuron-d6 (cat.# 31989) | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Liuron-d6 (cat.# 31990) | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Aflatoxins standard (cat.# 34121) | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Ochratoxin A (cat.# 34122) | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Compounds not present in these mixes were obtained separately. | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Diluent: | 75:25 Acetonitrile:water | ||||||||||||||||||||||||||||||||
Conc.: | 5-15 ng/mL (Expected concentration range in extract of brownie initially spiked at 100 ng/g.) | ||||||||||||||||||||||||||||||||
Inj. Vol.: | 2 µL | ||||||||||||||||||||||||||||||||
Mobile Phase | |||||||||||||||||||||||||||||||||
A: | Water, 2 mM ammonium formate, 0.1% formic acid | ||||||||||||||||||||||||||||||||
B: | Methanol, 2 mM ammonium formate, 0.1% formic acid | ||||||||||||||||||||||||||||||||
|
Detector | MS/MS |
---|---|
Ion Mode: | ESI+/ESI- |
Mode: | MRM |
Instrument | UHPLC |
Sample Preparation | Brownies were pulverized using a SPEX Freezer/Mill grinder and 0.5 g samples were fortified with pesticides and mycotoxins at 100 ng/g. A mix of internal standards was added at 200 ng/g. 1.5 mL of acetonitrile acidified with 1% acetic acid was added to the sample. The sample was vortexed and sonicated for 5 min, and then the supernatant was passed through a 100 mg Resprep C18 SPE cartridge (cat.# 26030). An additional 1.5 mL of extraction solvent (acidified acetonitrile) was added to the sample pellet, and then the sample was vortexed again. The supernatant was passed through the same C18 cartridge. 750 µL of extract was mixed with 250 µL of water, and then centrifuged for 5 min at low temperature (~7 ⁰C). 2 μL of final extract was injected into the LC-MS/MS system. |
Figura 2: Analisi GC MS/MS di pesticidi e micotossine nei brownie alla cannabis.

Peaks | tR (min) | Polarity | Precursor Ion | Product Ion | Transition Type | |
---|---|---|---|---|---|---|
1. | Atrazine-D5 | 7.5 | Positive | 220.0 | 58.0 | Quantifier |
2. | Atrazine-D5 | 7.5 | Positive | 205.0 | 127.0 | Qualifier |
3. | Quintozene | 7.8 | Positive | 294.9 | 236.9 | Quantifier |
4. | Quintozene | 7.8 | Positive | 236.8 | 118.9 | Qualifier |
5. | Methyl parathion | 8.2 | Positive | 263.0 | 109.0 | Quantifier |
6. | Methyl parathion | 8.2 | Positive | 263.0 | 79.0 | Qualifier |
7. | Captan | 9.1 | Positive | 184.0 | 149.1 | Quantifier |
8. | Captan | 9.1 | Positive | 184.0 | 134.1 | Qualifier |
9. | trans-Chlordane | 9.1 | Positive | 271.9 | 237.0 | Quantifier |
10. | trans-Chlordane | 9.1 | Positive | 372.9 | 265.9 | Qualifier |
11. | cis-Chlordane | 9.3 | Positive | 372.9 | 265.9 | Quantifier |
12. | cis-Chlordane | 9.3 | Positive | 271.9 | 237.0 | Qualifier |
13. | Chlorfenapyr | 9.5 | Positive | 247.1 | 227.1 | Quantifier |
14. | Chlorfenapyr | 9.5 | Positive | 59.1 | 31.1 | Qualifier |
15. | Cyfluthrin | 11.5 | Positive | 163.0 | 127.1 | Quantifier |
16. | Cyfluthrin | 11.5 | Positive | 199.1 | 170.1 | Qualifier |
17. | Cypermethrin | 11.7 | Positive | 163.0 | 127.1 | Quantifier |
18. | Cypermethrin | 11.7 | Positive | 181.1 | 152.1 | Qualifier |
Column | Rxi-5ms, 30 m, 0.25 mm ID, 0.25 µm (cat.# 13423) |
---|---|
Standard/Sample | California pesticide standard #1 (cat.# 34124) |
California pesticide standard #2 (cat.# 34125) | |
California pesticide standard #3 (cat.# 34126) | |
California pesticide standard #4 (cat.# 34127) | |
California pesticide standard #5 (cat.# 34128) | |
California pesticide standard #6 (cat.# 34129) | |
Atrazine-d5 (cat.# 31984) | |
Diluent: | Acetonitrile |
Conc.: | 5-7.5 ng/mL Expected concentration range in extract after extracting from brownie fortified at 100 ng/g (final extract was diluted in half with acetonitrile). |
Injection | |
Inj. Vol.: | 1 µL splitless |
Liner: | Topaz 4.0 mm ID single taper inlet liner w/wool (cat.# 23447) |
Inj. Temp.: | 250 °C |
Purge Flow: | 5 mL/min |
Oven | |
Oven Temp.: | 90 °C (hold 1 min) to 310 °C at 25 °C/min (hold 10 min) |
Carrier Gas | He, constant flow |
Flow Rate: | 1.4 mL/min |
Detector | MS/MS |
---|---|
Transfer Line Temp.: | 290 °C |
Analyzer Type: | Quadrupole |
Source Temp.: | 330 °C |
Electron Energy: | 70 eV |
Tune Type: | PFTBA |
Ionization Mode: | EI |
Instrument | Thermo Scientific TSQ 8000 Triple Quadrupole GC-MS |
Sample Preparation | Brownies were pulverized using a SPEX Freezer/Mill grinder and 0.5 g samples were fortified with pesticides and mycotoxins at 100 ng/g. A mix of internal standards was added at 200 ng/g. 1.5 mL of acetonitrile acidified with 1% acetic acid was added to the sample. The sample was vortexed and sonicated for 5 min, then the supernatant was passed through a 100 mg Resprep SPE C18 cartridge (cat.# 26030). An additional 1.5 mL of extraction solvent (acidified acetonitrile) was added to the sample pellet, and the sample was vortexed again. The supernatant was passed through the same C18 cartridge. After reserving 750 μL for LC-MS analysis, the remaining supernatant was transferred to a Q-sep QuEChERS dSPE tube containing pre-weighed magnesium sulfate and PSA (cat.# 26215). After vortexing and centrifuging, 500 μL of extract was mixed with 500 μL of acidified acetonitrile. 1 μL of final extract was injected into the GC-MS/MS system. |
Considerazioni sullo sviluppo del metodo: ottimizzazione della preparazione del campione
Dato che la nostra lista di composti target comprende un’ampia gamma di analiti con polarità e caratteristiche fisiche e chimiche diverse, per la preparazione del campione è essenziale adottare una metodologia non selettiva e garantire inoltre l’efficace eliminazione delle maggiori interferenze senza alcuna perdita degli analiti target. Abbiamo utilizzato l'acetonitrile, il solvente di estrazione utilizzato tradizionalmente nei metodi QuEChERS, perché consente di recuperare una vasta gamma di composti polari e non polari. Inizialmente abbiamo condotto prove sperimentali utilizzando 1 g di campione e almeno 5 mL di acetonitrile per ogni estrazione. Tuttavia, riducendo la dimensione del campione a 0,5 g, siamo riusciti ad abbassare il volume del solvente di estrazione a 3 mL per ciascun campione, pur nel rispetto delle norme californiane. Contenere gli sprechi di solvente rende più ecologiche le pratiche analitiche adottate e consente di diminuire i costi associati all’analisi del campione e allo smaltimento dei rifiuti. Alla luce di questi vantaggi, per i successivi esperimenti di ottimizzazione sono stati utilizzati campioni da 0,5 g e acetonitrile come solvente di estrazione.
Tra tutti gli analiti target, il daminozide è uno dei più complicati ed è stato necessario adeguare ulteriormente la procedura di estrazione per l’analisi di questo pesticida. Il daminozide è altamente polare (log P = -1,5), quindi è difficile da estrarre completamente dalla matrice di brownie, e non viene trattenuto facilmente in condizioni di fase inversa. Inoltre, i composti a basso peso molecolare, quali il daminozide, sono più soggetti a interferenze e a un elevato rumore di fondo quando si utilizza MS, soprattutto in caso di scarsa ritenzione cromatografica. Sono state testate diverse strategie per aumentare il recupero di daminozide in condizioni che fossero favorevoli anche per gli altri analiti target.
L’acidificazione del solvente di estrazione è stato il primo parametro valutato. A tal fine abbiamo confrontato l’effetto derivante dell’utilizzo dell’acetonitrile con acido acetico (AA) all’1% (v/v) rispetto all’estrazione con acetonitrile puro. La Figura 3 mostra i risultati relativi ai composti target che hanno presentato una differenza di almeno il 40% tra i trattamenti. In caso di estrazione con acetonitrile acidificato, la risposta relativa del daminozide è aumentata di circa l’80%, mentre la spiroxamine e l’ochratoxin A hanno mostrato rispettivamente un miglioramento della risposta del 45% e 47%. Sulla scorta di quanto emerso e del fatto che nessuno dei composti target ha mostrato una diminuzione significativa della risposta, abbiamo utilizzato acetonitrile con acido acetico all'1% come solvente di estrazione nel nostro flusso di lavoro finale per la preparazione del campione. Ciò offre un ulteriore vantaggio in quanto l’acidificazione degli estratti previene la degradazione del captan, un pesticida adatto all’analisi GC-MS/MS che si degrada facilmente a valori di pH neutri o elevati [2].
Il secondo parametro per la preparazione del campione che abbiamo esaminato è stato l’utilizzo di un’unica estrazione da 3 mL rispetto a un’estrazione in due fasi (da 1,5 mL cadauna). La Figura 4 riassume i risultati relativi agli analiti che hanno mostrato differenze statistiche (test t, valore p <0,05 a un livello di confidenza del 95%) tra le due condizioni di estrazioni (in entrambi i casi è stato utilizzato acetonitrile acidificato). È interessante notare che il daminozide ha mostrato il miglioramento più significativo, con un aumento del 40% nella risposta relativa. Gli altri analiti indicati nella figura hanno mostrato un miglioramento della risposta tra il 10 e il 20%. L’aumento delle risposte relative qui riscontrato con l’utilizzo di una seconda fase di estrazione dovrebbe comportare recuperi di estrazione del campione più elevati in campioni reali. Dato che questo effetto dipende da analita, matrice e solvente di estrazione, si raccomanda di effettuare sempre una valutazione alle condizioni sperimentali desiderate.Dopo l’estrazione con acetonitrile acidificato tutti i campioni sono stati sottoposti a una semplice fase di purificazione con cartucce SPE C18 per rimuovere le interferenze idrofobiche più significative co-estratte dai brownie. Dopodiché, i campioni per l’analisi LC-MS/MS e GC-MS/MS sono stati trattati in modo diverso. I campioni LC-MS/MS sono stati diluiti in acqua e centrifugati, rendendo possibile la separazione dei lipidi rimanenti che non erano stati trattenuti nella cartuccia SPE in quanto meno solubili nell’estratto finale una volta aggiunta l’acqua. I campioni GC-MS/MS sono stati sottoposti a purificazione dSPE con solfato di magnesio e ammina primaria e secondaria (PSA) per rimuovere umidità e zuccheri prima dell’analisi. Si noti che la PSA può legarsi solo a pesticidi come il daminozide e la spiroxamine, quindi la procedura dSPE è stata condotta solo sui pesticidi soggetti a GC.
Figura 3: Effetto dell’acidificazione del solvente di estrazione (n=3). Le barre di errore rappresentano le deviazioni standard.
Figura 4: Confronto tra le risposte relative corrispondenti all’estrazione in due fasi rispetto all’estrazione in fase singola (n=3).
Considerazioni sullo sviluppo del metodo: minimizzazione degli effetti della matrice
È risaputo che la ionizzazione elettrospray è soggetta a effetti di soppressione/potenziamento causati da interferenze della matrice co-estratta. Questi problemi possono essere superati adeguando il metodo di preparazione del campione applicando condizioni più selettive, utilizzando uno standard interno idoneo e/o adeguando il metodo cromatografico per risolvere gli analiti derivanti da interferenze coeluenti. Per questo motivo, dopo aver selezionato le condizioni sperimentali per l’analisi di pesticidi e micotossine nei brownie alla cannabis è stata condotta una valutazione degli effetti assoluti della matrice secondo la metodologia proposta da Matuszewski et al. [3]. Per stimare gli effetti assoluti della matrice, sono stati messi a confronto il bianco della matrice e il solvente puro, entrambi fortificati alla medesima concentrazione (15 ppb), analizzando la risposta di tutti gli analiti target fortificati. Come illustrato nella Figura 5, solo il daminozide ha mostrato un deciso miglioramento della risposta. Considerando la scarsa ritenzione del daminozide alle condizioni di gradiente LC selezionate per questo studio, è probabile che questo pesticida coeluisca con le numerose interferenze non trattenute che sono presenti in genere in matrici come i brownie. In base a questi risultati, il daminozide-D6 è stato aggiunto al gruppo di standard interni per correggere in modo mirato eventuali variazioni collegate alla risposta del daminozide.
Figura 5: Effetti assoluti della matrice per pesticidi e micotossine soggetti a LC.
Oltre a indagare gli effetti assoluti della matrice, abbiamo valutato i recuperi assoluti di analiti alle condizioni del metodo finale. A tal fine, le risposte relative a estratti di brownie ottenuti da campioni fortificati a 100 ng/g (prima dell'estrazione) sono state confrontate con i bianchi della matrice di brownie successivamente fortificati (dopo l’estrazione) con la stessa quantità di analiti. Come mostrato nella Figura 6, senza considerare il daminozide, i recuperi più bassi di analiti (68%) sono stati riscontrati per la spiroxamine e l’ochratoxin A. Nonostante i numerosi tentativi di aumentare la risposta del daminozide è stato possibile recuperare solo il 30% della quantità addizionata inizialmente. Ciò dimostra che l’approccio migliore per ottenere risultati affidabili e accurati quando si analizzano pesticidi e micotossine nei brownie alla cannabis è utilizzare una matrice (bianco) surrogata per preparare diversi livelli di calibrazione e impiegare un analogo deuterato per il daminozide. L’utilizzo di calibratori preparati in solvente e l’assenza di adeguati standard interni potrebbero facilmente distorcere le misurazioni.
Figura 6: Recuperi assoluti di pesticidi e micotossine alle condizioni ottimizzate (n=3).
Risultati della validazione del metodo
Le prestazioni del metodo nell'analisi di pesticidi e micotossine nei brownie alla cannabis sono state valutate in termini di linearità, accuratezza e precisione. Una sintesi dei risultati è riportata nella Tabella III.
Le curve di calibrazione sono state costruite mettendo a grafico il rapporto tra l’area dell’analita e quella dello standard interno rispetto alle concentrazioni di analiti in standard di matrice di brownie fortificati in un range di 5–700 ng/g. A tutte le curve di calibrazione è stato applicato un fattore di ponderazione di 1/x. La maggioranza dei composti ha mostrato un’eccellente linearità, come dimostrato dai valori R2 pari a ≥0,9990 (i valori variavano da 0,9939 a 0,9999).
L’accuratezza e la precisione sono state valutate a tre livelli di concentrazione selezionati per coprire il range lineare: basso (10 ng/g), medio (100 ng/g), e alto (500 ng/g). Sono stati ottenuti risultati eccellenti per tutti gli analiti target, perché l’utilizzo di standard preparati in matrice ha ridotto al minimo il potenziamento e la soppressione della matrice. I valori di recupero variavano dal 71,2% al 116% e i valori di RSD erano tutti inferiori al 25%, indicando un buon livello di accuratezza e precisione.
La maggioranza degli analiti ha mostrato valori di LOQ inferiori a 10 ng/g ed è stato dimostrato che la metodologia proposta consente la quantificazione di tutti i composti target a concentrazioni inferiori ai livelli di azione richiesti dallo stato della California per i prodotti a base di cannabis. Il ciflutrin e la cypermethrin hanno mostrato valori di LOQ inferiori in GC-MS/MS che non in LC-MS/MS, ma possono comunque essere analizzati ai livelli di azione richiesti con entrambi gli strumenti. Il valore di LOQ per ciascun composto è stato definito come la più bassa concentrazione con un rapporto segnale/rumore pari ad almeno 10, una differenza inferiore al 25% tra la concentrazione fortificata e la concentrazione stimata, e un valore di precisione delle repliche inferiore al 25%.
La stabilità dei composti target negli estratti LC dopo 24 e 48 ore di stoccaggio nell’autocampionatore a 10 ⁰C (n=4) è stata valutata relativamente alle intensità di picco di campioni preparati al momento (0 ore). La maggior parte dei composti ha mostrato un cambiamento nella risposta inferiore al 10% sull’intero periodo oggetto di studio.
Tabella III: Risultati di validazione per il metodo finale ottimizzato per l’analisi di pesticidi e micotossine nei brownie alla cannabis. I risultati sono stati determinati mediante analisi LC-MS/MS, fatta eccezione per i composti sottoposti ad analisi GC-MS/MS, come indicato.
Pesticide | Action Level (ng/g) for Non-Inhalable Cannabis Goods | LOQ (ng/g) | R2 | Low QC (10 ng/g) | Medium QC (100 ng/g) | High QC (500 ng/g) | |||
Accuracy (%Recovery) | Precision (%RSD) | Accuracy (%Recovery) | Precision (%RSD) | Accuracy (%Recovery) | Precision (%RSD) | ||||
Daminozide* | <LOD | 25 | 0.9954 | — | — | 102 | 11.7 | 92.1 | 9.73 |
Acephate | 5000 | 10 | 0.9944 | 100 | 17.9 | 104 | 2.82 | 97.5 | 4.21 |
Thiamethoxam | 4500 | 5 | 0.9979 | 102 | 9.77 | 106 | 1.04 | 103 | 2.14 |
Methomyl | 100 | 5 | 0.9996 | 105 | 4.49 | 104 | 0.986 | 103 | 1.26 |
Oxamyl | 200 | 5 | 0.9986 | 107 | 8.74 | 104 | 1.71 | 103 | 1.95 |
Imidacloprid | 3000 | 10 | 0.9979 | 84.2 | 18.2 | 103 | 2.47 | 100 | 2.73 |
Dimethoate* | <LOD | 5 | 0.9994 | 103 | 4.58 | 101 | 2.72 | 101 | 3.93 |
Acetamiprid | 5000 | 5 | 0.9991 | 105 | 7.26 | 103 | 1.00 | 100 | 2.52 |
Thiacloprid* | <LOD | 5 | 0.9993 | 101 | 6.48 | 106 | 2.90 | 100 | 2.19 |
Aldicarb* | <LOD | 5 | 0.9988 | 104 | 16.2 | 98.8 | 4.16 | 100 | 5.46 |
Naled | 500 | 25 | 0.9962 | — | — | 105 | 9.83 | 103 | 1.37 |
Mevinphos I (79%)a* | <LOD | 4 | 0.9991 | 110 | 13.2 | 104 | 4.32 | 102 | 3.57 |
Mevinphos II (21%)b* | <LOD | 2 | 0.9981 | 109 | 24.0 | 106 | 5.58 | 98.3 | 5.71 |
Carbofuran* | <LOD | 5 | 0.9994 | 98.9 | 4.18 | 105 | 2.38 | 100 | 1.45 |
Carbaryl | 500 | 5 | 0.9997 | 87.8 | 9.83 | 103 | 3.86 | 103 | 1.47 |
Dichlorvos* | 100 | 5 | 0.9949 | 79.5 | 1.95 | 101 | 4.53 | 97.8 | 7.51 |
Propoxur* | <LOD | 5 | 0.9993 | 100 | 4.79 | 106 | 1.72 | 100 | 2.59 |
Chlorantraniliprole | 40,000 | 10 | 0.9992 | 85.0 | 3.84 | 105 | 4.94 | 97.7 | 1.40 |
Imazalil* | <LOD | 5 | 0.9993 | 97.7 | 11.7 | 100 | 1.46 | 98.1 | 2.27 |
Metalaxyl | 15,000 | 5 | 0.9996 | 101 | 8.15 | 103 | 4.11 | 101 | 2.40 |
Azoxystrobin | 40,000 | 5 | 0.9998 | 102 | 3.39 | 103 | 0.635 | 102 | 1.04 |
Myclobutanil | 9000 | 5 | 0.9997 | 102 | 5.95 | 104 | 4.07 | 100 | 2.89 |
Phosmet | 200 | 5 | 0.9997 | 102 | 3.89 | 103 | 3.09 | 99.3 | 3.32 |
Spiroxamine* | <LOD | 5 | 0.9987 | 100 | 6.68 | 102 | 4.69 | 102 | 0.915 |
Fenoxycarb* | <LOD | 5 | 0.9995 | 99.2 | 2.37 | 103 | 2.24 | 100 | 2.06 |
Methiocarb* | <LOD | 5 | 0.9997 | 104 | 18.0 | 104 | 3.78 | 102 | 0.746 |
Spiromesifen | 12,000 | 25 | 0.9994 | — | — | 103 | 5.12 | 101 | 3.39 |
Boscalid | 10,000 | 5 | 0.9998 | 95.0 | 10.6 | 106 | 3.36 | 100 | 3.34 |
Paclobutrazol* | <LOD | 5 | 0.9996 | 97.3 | 13.1 | 103 | 2.94 | 97.2 | 3.49 |
Malathion | 5000 | 5 | 0.9995 | 71.2 | 13.3 | 102 | 2.59 | 99.5 | 3.18 |
Dimethomorph I (39%)c | 20,000** | 4 | 0.9994 | 85.4 | 17.9 | 101 | 5.17 | 102 | 3.41 |
Dimethomorph II (61%)d | 20,000** | 3 | 0.9994 | 91.7 | 13.7 | 103 | 2.15 | 100 | 1.60 |
Tebuconazole | 2000 | 5 | 0.9996 | 101 | 11.0 | 104 | 2.15 | 101 | 4.08 |
Bifenazate | 5000 | 5 | 0.9999 | 111 | 6.58 | 104 | 1.97 | 100 | 3.58 |
Fenhexamid | 10,000 | 10 | 0.9992 | 78.0 | 15.5 | 103 | 3.05 | 100 | 2.28 |
Propiconazole | 20,000 | 5 | 0.9997 | 100 | 5.38 | 105 | 2.19 | 101 | 1.14 |
Spirotetramat | 13,000 | 5 | 0.9990 | 101 | 13.8 | 104 | 2.04 | 101 | 4.28 |
Ethoprophos* | <LOD | 5 | 0.9997 | 110 | 8.84 | 103 | 1.76 | 99.5 | 2.17 |
Kresoxym-methyl | 1000 | 5 | 0.9993 | 102 | 16.6 | 104 | 3.02 | 99.0 | 2.78 |
Spinosad- spinosyn A (71 %)e | 3000** | 3.5 | 0.9994 | 97.3 | 3.95 | 102 | 2.06 | 101 | 2.62 |
Diazinon | 200 | 5 | 0.9995 | 103 | 3.29 | 101 | 2.93 | 101 | 2.20 |
Coumaphos* | <LOD | 5 | 0.9997 | 101 | 5.71 | 102 | 0.739 | 97.8 | 3.02 |
Clofentezine | 500 | 5 | 0.9997 | 99.3 | 9.11 | 103 | 2.21 | 100 | 2.62 |
Spinosad - spinosyn D (29%)f | 3000** | 1.5 | 0.9990 | 103 | 9.75 | 101 | 4.37 | 97.1 | 4.99 |
Spinetoram - spinosyn J (80%)g | 3000** | 4 | 0.9991 | 102 | 7.14 | 105 | 1.79 | 100 | 2.58 |
Spinetoram - spinosyn L (20%)h | 3000** | 1 | 0.9991 | 97.8 | 4.45 | 100 | 3.53 | 99.1 | 1.15 |
Trifloxystrobin | 30,000 | 5 | 0.9997 | 106 | 2.76 | 102 | 1.76 | 101 | 1.81 |
Prallethrin | 400 | 25 | 0.9996 | 96.6 | 20.9 | 97.5 | 7.96 | 99.2 | 5.04 |
Hexythiazox | 2000 | 5 | 0.9996 | 103 | 5.96 | 104 | 3.30 | 98.3 | 3.14 |
Cyfluthrin | 1000 | 50 | 0.9988 | — | — | 107 | 6.81 | 102 | 10.5 |
Pyrethrin I (54%)i | 1000** | 5.4 | 0.9998 | 92.5 | 9.14 | 104 | 1.91 | 99.2 | 1.65 |
Pyrethrin II (34%)j | 1000** | 26 | 0.9990 | — | — | 100 | 10.9 | 98.7 | 3.44 |
Etoxazole | 1500 | 5 | 0.9998 | 102 | 5.82 | 102 | 1.09 | 100 | 1.46 |
Piperonyl butoxide | 8000 | 5 | 0.9998 | 103 | 4.56 | 103 | 2.45 | 101 | 3.43 |
Chlorpyrifos* | <LOD | 5 | 0.9994 | 98.0 | 10.2 | 101 | 3.69 | 100 | 1.93 |
Permethrin-cis (41%)k | 20,000** | 4.1 | 0.9994 | 92.5 | 10.8 | 105 | 3.69 | 99.3 | 3.87 |
Permethrin-trans (59%)l | 20,000** | 5.9 | 0.9999 | 116 | 5.48 | 106 | 3.61 | 97.4 | 2.75 |
Fenpyroximate | 2000 | 5 | 0.9998 | 101 | 6.74 | 103 | 4.08 | 100 | 3.35 |
Bifenthrin | 500 | 5 | 0.9994 | 107 | 2.93 | 103 | 4.98 | 101 | 2.07 |
AbamectinB1a | 300 | 10 | 0.9999 | 84.9 | 20.1 | 105 | 6.26 | 101 | 3.99 |
Cypermethrin | 1000 | 25 | 0.9991 | — | — | 93.3 | 6.76 | 98.8 | 7.62 |
Etofenprox* | <LOD | 5 | 0.9995 | 96.2 | 7.96 | 107 | 2.03 | 101 | 2.78 |
Pyridaben | 3000 | 10 | 0.9989 | 105 | 20.7 | 101 | 5.39 | 100 | 2.48 |
Acequinocyl | 4000 | 5 | 0.9987 | 91.1 | 11.0 | 103 | 5.47 | 104 | 4.81 |
Flonicamid | 2000 | 10 | 0.9993 | 89.6 | 18.3 | 101 | 3.62 | 101 | 3.15 |
Fipronil* | <LOD | 10 | 0.9993 | 100 | 19.5 | 102 | 4.64 | 97.8 | 4.58 |
Fludioxonil | 30,000 | 5 | 0.9995 | 109 | 11.6 | 104 | 6.13 | 99.3 | 3.39 |
Aflatoxin G2 | 20** | 5 | 0.9987 | 102 | 19.1 | 104 | 2.74 | — | — |
Aflatoxin G1 | 20** | 5 | 0.9984 | 116 | 11.2 | 96.4 | 1.20 | — | — |
Aflatoxin B2 | 20** | 5 | 0.9996 | 105 | 10.4 | 98.7 | 1.77 | — | — |
Ochratoxin A | 20 | 10 | 0.9943 | 91.1 | 11.5 | 112 | 10.6 | — | — |
Aflatoxin B1 | 20** | 5 | 0.9990 | 106 | 11.4 | 96.0 | 3.23 | — | — |
Captan† | 5000 | 10 | 0.9941 | 112 | 14.8 | 103 | 5.25 | 108 | 5.28 |
Chlordane†* | <LOD | 25 | 0.9939 | — | — | 106 | 5.32 | 93.6 | 4.60 |
Chlorfenapyr†* | <LOD | 25 | 0.9953 | — | — | 102 | 3.19 | 99.2 | 4.95 |
Methyl parathion†* | <LOD | 5 | 0.9976 | 103 | 6.59 | 103 | 1.83 | 92.7 | 5.22 |
Pentachloronitrobenzene† | 200 | 5 | 0.9975 | 98.2 | 9.75 | 103 | 3.76 | 100 | 4.45 |
Cyfluthrin† | 1000 | 5 | 0.9983 | 108 | 9.27 | 103 | 4.10 | 103 | 3.26 |
Cypermethrin† | 1000 | 10 | 0.9986 | 103 | 12.3 | 103 | 2.13 | 102 | 1.97 |
†Reported results were determined by GC-MS/MS.
*Category I pesticides, LOQ is ≤100 ng/g
**Action level is the total concentration of both isomers together.
Results are calculated based on relative contribution of each isomer to the overall fortification levels as follows:
aMevinphos I: low: 8 ng/g; medium: 79 ng/g; high: 395 ng/g
bMenvinphos II: low: 2 ng/g; medium: 21 ng/g; high: 105 ng/g
cDimethomorph I: low: 4 ng/g; medium: 39 ng/g; high: 195 ng/g
dDimethomorph II: low: 6 ng/g; medium: 61 ng/g; high: 305 ng/g
eSpinosad- spinosyn A: low: 7 ng/g; medium: 71 ng/g; high: 355 ng/g
fSpinosad - spinosyn D: low: 3 ng/g; medium: 29 ng/g; high: 145 ng/g
gSpinetoram - spinosyn J: low: 8 ng/g; medium: 80 ng/g; high: 400 ng/g
hSpinetoram - spinosyn L: low: 2 ng/g; medium: 20 ng/g; high: 100 ng/g
iPyrethrin I: low: 5 ng/g; medium: 54 ng/g; high: 270 ng/g
jPyrethrin II: low: 3 ng/g; medium: 34 ng/g; high: 170 ng/g
kPermethrin-cis: low: 4 ng/g; medium: 41 ng/g; high: 205 ng/g
lPermethrin-trans: low: 6 ng/g; medium: 59 ng/g; high: 295 ng/g
Conclusioni
È stato sviluppato un flusso di lavoro efficace per l'analisi di pesticidi e micotossine in brownie alla cannabis e sono state illustrate in dettaglio le strategie di ottimizzazione volte a fornire un punto di partenza per matrici simili. Tutti i composti soggetti ad analisi LC-MS/MS e GC-MS/MS sono stati estratti impiegando acetonitrile acidificato e successivamente purificati utilizzando cartucce SPE C18. Per i campioni GC-MS/MS è stato necessario effettuare una purificazione dSPE supplementare con solfato di magnesio e PSA. L’utilizzo di acetonitrile acidificato si è dimostrato cruciale nel recupero di analiti quali daminozide, spiroxamine e ochratoxin A. Tutti i composti target hanno restituito risultati eccellenti in termini di valori di LOQ, linearità, accuratezza e precisione. Questa metodologia prevede l’utilizzo di soli 3 mL di solvente di estrazione per ciascun campione, consentendo quindi anche di ridurre significativamente l’utilizzo/lo spreco di solvente. Gli estratti hanno presentato una stabilità accettabile anche dopo 48 ore nell’autocampionatore LC.
Bibliografia
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- B. K. Matuszewski, M. L. Constanzer, C. M. Chavez-Eng, Strategies for the assessment of matrix effect in quantitative bioanalytical methods based on HPLC−MS/MS, Anal. Chem. 75 (2003) 3019–3030. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/ac020361s