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L’analisi di pesticidi e micotossine nei brownie alla cannabis

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Abstract

I regolamenti governativi della California impongono all’industria della cannabis di sottoporre i prodotti alimentari all’analisi di una lunga lista di pesticidi e micotossine. Nel presente studio è stato sviluppato un flusso di lavoro efficace per eseguire questa analisi complessa sui brownie, e vengono illustrate in dettaglio alcune strategie di ottimizzazione volte a fornire un punto di partenza per matrici simili. Sono stati impiegati i metodi LC-MS/MS e GC-MS/MS e per tutti i composti target sono stati raggiunti eccellenti risultati a livello di LOQ, linearità, accuratezza e precisione.

Introduzione

La legalizzazione della cannabis (marijuana) per scopi ricreativi e medici richiede metodi analitici accurati e affidabili per valutare la qualità e la sicurezza di qualsiasi prodotto derivato dalla cannabis. Per sviluppare metodi efficaci occorre considerare attentamente le proprietà degli analiti e gli effetti della matrice, e le analisi sono ulteriormente complicate dal fatto che i requisiti variano a seconda del Paese e dei diversi tipi di prodotto. Tra i numerosi prodotti a base di cannabis disponibili in commercio, quelli commestibili rappresentano una delle categorie più diffuse e comprendono un'ampia varietà di prodotti, quali diversi tipi di bevande, cioccolatini, prodotti da forno e caramelle, solo per citarne alcuni. Attualmente lo stato della California richiede l’analisi di una lunga lista di pesticidi e micotossine non solo nel fiore di cannabis, ma anche nei prodotti derivati da questa pianta [1]. Per questa ragione, è fondamentale elaborare metodi in grado di affrontare le sfide poste dai diversi tipi di matrice.

Questo articolo descrive lo sviluppo di un metodo di test per l'analisi di pesticidi e micotossine nei brownie alla cannabis in base alla lista stilata dal governo californiano. Abbiamo scelto i brownie come matrice modello in quanto sono molto diffusi tra i consumatori di prodotti alimentari a base di cannabis, ma anche perché contengono livelli elevati di potenziali interferenze (carboidrati e grassi). Illustreremo il lavoro di sviluppo che abbiamo dovuto effettuare per ottimizzare il metodo per l’analisi dei brownie, che proponiamo come punto di riferimento per laboratori che sviluppano metodi per prodotti alimentari simili (per esempio, biscotti o altri prodotti da forno). Il metodo finale qui stabilito per l’analisi di pesticidi e micotossine nei brownie alla cannabis ha fornito risultati eccellenti in termini di linearità, accuratezza, precisione e limiti di quantificazione (limit of quantification, LOQ).

Studio sperimentale

Inizialmente è stato eseguito un lavoro di sviluppo del metodo per ottimizzare la procedura di preparazione dei campioni e per valutare l’impatto degli effetti della matrice sull’analisi quantitativa. L'esito di tali esperimenti viene discusso nella sezione dedicata ai risultati, e viene qui presentata la metodologia finale raccomandata per l’analisi di pesticidi e micotossine nei brownie alla cannabis.

Preparazione del campione

Per un campione solido come i brownie, la prima fase della preparazione del campione è l’omogeneizzazione della matrice. Per ridurre il campione in polvere molto fine abbiamo utilizzato un mulino SPEX Freezer/Mill. I campioni sono stati preraffreddati per 2 minuti, e dopo tre cicli da 2 minuti ciascuno di triturazione (a 15 cps) e 1 minuto di raffreddamento è stata ottenuta una polvere sfusa e omogenea facile da lavorare. (In alternativa si potrebbe utilizzare un robot da cucina con ghiaccio secco).

Per il bianco è stata pesata una matrice di brownie polverizzata (0,5 g) in un vial di vetro da 4,0 mL (cat.# 24654) e fortificata con pesticidi e micotossine ai livelli definiti nella Tabella I. Una miscela di standard interni è stata aggiunta a 200 ng/g (composti elencati nella Tabella II). 1,5 mL di acetonitrile acidificato con 1% di acido acetico è stato aggiunto al campione. Il campione è stato vortexato e sonicato per 5 minuti (non è stata necessaria la centrifuga), quindi il surnatante è stato fatto passare attraverso una cartuccia SPE Resprep C18 da 100 mg (cat.# 26030). Al pellet del campione sono stati aggiunti ulteriori 1,5 mL di solvente di estrazione (acetonitrile acidificato) e poi il campione è stato vortexato di nuovo. Il surnatante è stato fatto passare attraverso la stessa cartuccia C18.

Per l'analisi LC-MS/MS, 750 µL di surnatante sono stati miscelati a 250 µL di acqua e il tutto è stato poi centrifugato per 5 minuti a bassa temperatura (~7 ⁰C). Un’aliquota di 2 μL di estratto finale è stata iniettata nel sistema LC-MS/MS.

Per l’analisi GC-MS/MS, il surnatante rimanente è stato trasferito in una provetta Q-sep QuEChERS dSPE contenente solfato di magnesio e PSA pre-pesati (cat.# 26215). Dopo il passaggio al vortex e la centrifuga, 500 μL di estratti sono stati miscelati a 500 μL di acetonitrile acidificato. Un’aliquota di 1 μL di estratto finale è stata iniettata nel sistema GC-MS/MS.

Standard di calibrazione e campioni di controllo qualità (QC)

Una curva di calibrazione a nove punti con un range compreso tra 5 e 700 ng/g è stata preparata in triplicato nella matrice per valutare la linearità e consentire l’analisi quantitativa. Per valutare l'accuratezza e la precisione del metodo, sono stati preparati in quadruplicato tre diversi livelli di concentrazione QC (10, 100, e 500 ng/g). Sia per gli standard di calibrazione che per i campioni QC, per il bianco sono stati pesati 0,5 g di matrice di brownie polverizzata in un vial di vetro da 4 mL. Nella Tabella I sono riportati i µL di soluzione madre aggiunti a ogni vial per ottenere concentrazioni diverse nella matrice.

Tabella I: Preparazione dello standard di calibrazione e livelli di concentrazione dei campioni QC.

Description Concentration in
Matrix (ng/g)
Volume of Fortification
Solution Added (µL)
Concentration of
Fortification Solution (ng/mL)
Calibration 1 5 10 250
QC Low 10 20 250
Calibration 2 25 50 250
Calibration 3 50 25 1000
Calibration 4 75 37.5 1000
QC Medium 100 50 1000
Calibration 5 150 15 5000
Calibration 6 200 20 5000
Calibration 7 300 30 5000
Calibration 8 400 40 5000
QC High 500   50 5000
Calibration 9 700 70 5000
 
Tabella II: Standard interni (ISTD) e composti target per analisi LC (per l’analisi GC illustrata nella Figura 2 è stata utilizzata atrazina-D5)
 
Compound Type ISTD Group
Daminozide-D6 ISTD 8
Daminozide Target 8
Acephate Target 3
Oxamyl Target 2
Flonicamid Target 3
Methomyl Target 2
Thiamethoxam Target 2
Imidacloprid Target 2
Mevinphos I Target 2
Mevinphos II Target 2
Acetamiprid Target 1
Dimethoathe-D6 ISTD 3
Dimethoate Target 3
Thiacloprid Target 1
Aldicarb Target 2
Dichlorvos Target 4
Dichlorvos-D6 ISTD 4
Imazalil Target 1
Carbofuran Target 1
Propoxur Target 1
Carbaryl-D7 ISTD 5
Carbaryl Target 5
Diuron-D6 ISTD 2
Atrazine-D5 ISTD 7
Naled Target 2
Metalaxyl Target 2
Spiroxamin Target 1
Chlorantraniliprole Target 2
Phosmet Target 1
Azoxystrobin Target 2
Linuron-D6 ISTD 1
Fludioxonil Target 1
Methiocarb Target 2
Boscalid Target 1
Dimethomorph I Target 2
Paclobutrazol Target 1
Dimethomorph II Target 2
Malathion Target 1
Myclobutanil Target 1
Bifenazate Target 1
Fenhexamid Target 1
Spirotetramat Target 1
Fipronil Target 1
Ethoprophos Target 1
Fenoxycarb Target 1
Kresoxim methyl Target 6
Tebuconazole Target 1
Diazinon-D10 ISTD 6
Diazinon Target 6
Spinosad A Target 6
Pyridaben Target 6
Coumaphos Target 6
Propiconazole Target 1
Clofentezine Target 1
Spinosad (Spinosyn D) Target 6
Spinetoram (Spinosyn J) Target 6
Prallethrin Target 1
Trifloxystrobin Target 6
Pyrethrin II Target 6
Spinetoram (Spinosyn L) Target 6
Piperonyl butoxide Target 1
Chlorpyrifos Target 1
Hexythiazox Target 1
Etoxazole Target 6
Spiromesifen Target 6
Pyrethrin I Target 1
Cyfluthrin Target 1
Fenpyroximate Target 6
Cypermethrin Target 2
Abamectine Target 6
Permethrin-trans Target 6
Permethrin-cis Target 6
Etofenprox Target 6
Bifenthrin Target 2
Acequinocyl 343 Target 6
Acequinocyl 402 Target 6
Aflatoxin G2 Target 1
Aflatoxin G1 Target 1
Aflatoxin B2 Target 1
Ochratoxin A Target 1
Aflatoxin B1 Target 1
 

Parametri dello strumento

L’analisi LC-MS/MS di pesticidi e micotossine nei brownie alla cannabis è stata effettuata utilizzando una colonna analitica Raptor ARC-18 da 2,7 µm x 100 mm x 2,1 mm (cat.# 9314A12) e uno Shimadzu LCMS-8060 LC-MS/MS. I parametri generali dello strumento, la polarità ESI di ciascun composto e le transizioni degli analiti sono riportati nella Figura 1.

L’analisi GC-MS/MS è stata effettuata utilizzando una colonna analitica Rxi-5ms (cat.# 13423) da 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm e un Thermo Scientific TSQ 8000 Triple Quadrupole GC-MS/MS. I parametri dello strumento e le transizioni degli analiti sono riportati nella Figura 2. Si noti che per questa applicazione è stato importante utilizzare un liner a cono singolo con lana (cat.# 23447). L’impaccamento in lana aumenta la vaporizzazione e la miscelazione/omogeneizzazione con il carrier gas per una migliore riproducibilità, e il cono nella parte inferiore del liner incanala gli analiti nella colonna, riducendo le potenziali interazioni con la guarnizione dell’iniettore. Inoltre, è stato impiegato un tempo di mantenimento di 10 min alla fine di ciascuna corsa per evitare il carry over dei composti e interferenze con le analisi successive.

Risultati e discussione

Prestazione cromatograficaPer coprire tutti i composti regolati dallo stato di California abbiamo sviluppato i metodi LC-MS/MS e GC-MS/MS. Sebbene sia facile analizzare la maggioranza dei pesticidi utilizzando il metodo LC-MS/MS, i pesticidi idrofobici, quali il chlordane, il methyl parathion, il captan, il chlorfenapyr, e il pentachloronitrobenzene (PCNB), non possono essere rilevati o sono scarsamente ionizzati in condizioni di ionizzazione elettrospray. Altri pesticidi, come il cyfluthrin e la cypermethrin, hanno invece una scarsa risposta in modalità ESI, ma possono essere analizzati sia il metodo strumentale GC-MS/MS che LC-MS/MS Al fine di ottenere una risposta ESI accettabile per questi due analiti, le temperature della sorgente di ionizzazione dovrebbero essere impostate su valori relativi bassi. Nel nostro caso, le temperature dell’interfaccia, della linea di desolvatazione e del blocco riscaldante sono state tutte impostate a 100 °C. In questo studio, chlordane, methyl parathion, captan, chlorfenapyr, and pentachloronitrobenzene (PCNB) sono stati analizzati utilizzando GC-MS/MS; mentre cyfluthrin e cypermethrin sono stati analizzati utilizzando entrambi gli strumenti, e il resto dei pesticidi e delle micotossine è stato analizzato utilizzando solo il metodo LC-MS/MS. Le Figure 1 e 2 mostrano rispettivamente i cromatogrammi LC e GC per gli analiti target. Uno dei principali vantaggi delle nostre condizioni di gradiente LC è che tutte le micotossine eluiscono in 2,4 - 3,6 minuti, mentre i principali cannabinoidi, quali CBD, CBG, CBN, THC, e THCA-A, cominciano a eluire dopo 5,6 minuti. In base a un confronto con uno standard misto di cannabinoidi analizzati alle stesse condizioni impiegate qui, le uniche coeluizioni tra gli analiti target e i principali cannabinoidi sarebbero tra CBD e piperonyl butoxide (5.7 min), CBG e chlorpyrifos (5.8), e cyfluthrin e CBN (6.5 min). In nessun composto target ci sono state coeluizioni tra THC (delta 8 e 9) e THCA-A.

Figura 1: Analisi LC-MS/MS di pesticidi e micotossine nei brownie alla cannabis.

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LC_GN0602
  Peaks tR (min) Precursor Ion Product Ion 1 Product Ion 2 Polarity
1. Daminozide-d6 0.6 167.0 149.3 49.3 +
2. Daminozide 0.7 161.1 44.1 143.2 +
3. Acephate 1.5 184.0 143.1 95.1 +
4. Oxamyl 1.8 237.1 72.1 90.1 +
5. Flonicamid 1.9 230.1 203.1 174.1 +
6. Methomyl 1.9 163.1 88.1 106.1 +
7. Thiamethoxam 1.9 292.0 211.1 181.1 +
8. Imidacloprid 2.2 256.1 209.1 175.1 +
9. Mevinphos I 2.2 225.1 127.1 193.2 +
10. Acetamiprid 2.2 223.0 126.1 56.1 +
11. Dimethoathe-d6 2.2 236.1 205.1 - +
12. Dimethoate 2.3 230.0 199.1 125.1 +
13. Thiacloprid 2.4 253.0 126.0 90.1 +
14. Mevinphos II 2.4 225.1 127.1 193.2 +
15. Aflatoxin G2 2.4 331.2 189.3 115.2 +
16. Aflatoxin G1 2.4 329.2 243.2 215.3 +
17. Aldicarb 2.5 116.0 89.2 70.2 +
18. Aflatoxin B2 2.5 315.3 287.2 243.3 +
19. Dichlorvos 2.6 220.9 109.1 79.2 +
20. Dichlorvos-d6 2.6 227.0 115.1 - +
21. Aflatoxin B1 2.6 313.2 241.2 128.2 +
22. Imazalil 2.6 297.0 159.0 201.0 +
23. Carbofuran 2.6 222.1 123.1 165.2 +
24. Propoxur 2.6 210.1 111.1 93.1 +
25. Carbaryl-d7 2.7 209.2 152.2 - +
26. Carbaryl 2.7 202.1 145.1 127.1 +
27. Diuron-d6 2.9 239.1 78.2 - +
28. Atrazine-d5 2.9 221.2 179.1 - +
29. Naled 2.9 397.8 127.1 109.1 +
30. Metalaxyl 2.9 280.2 220.2 192.2 +
31. Spiroxamine 2.9 298.3 144.2 100.2 +
32. Chlorantraniliprole 3.0 483.9 452.9 285.9 +
33. Phosmet 3.0 318.0 160.1 77.2 +
34. Azoxystrobin 3.1 404.0 372.1 344.1 +
35. Linuron-d6 3.1 255.1 160.1 - +
36. Fludioxonil 3.2 247.0 180.0 126.0 -
37. Methiocarb 3.2 226.1 169.1 121.1 +
38. Dimethomorph I 3.2 388.2 301.2 165.3 +
39. Boscalid 3.2 342.9 307.1 140.1 +
40. Paclobutrazol 3.3 294.3 70.1 125.1 +
41. Malathion 3.3 331.0 127.2 285.2 +
42. Dimethomorph II 3.4 388.2 301.2 165.3 +
43. Myclobutanil 3.4 289.1 70.1 125.1 +
44. Bifenazate 3.4 301.0 198.1 170.2 +
45. Ochratoxin A 3.5 404.2 239.1 358.3 +
46. Fenhexamid 3.5 302.1 97.1 55.2 +
47. Spirotetramat 3.7 374.2 302.1 216.1 +
48. Ethoprophos 3.8 243.1 131.1 97.1 +
49. Fipronil 3.8 436.8 331.8 251.9 -
50. Fenoxycarb 3.9 302.1 88.1 116.1 +
51. Kresoxim-methyl 4.1 314.2 267.2 222.2 +
52. Tebuconazole 4.2 308.1 70.1 125.1 +
53. Diazinon-d10 4.2 315.2 170.2 - +
54. Spinosyn A (spinosad) 4.3 732.4 142.2 98.1 +
55. Diazinon 4.3 305.1 169.2 153.2 +
56. Coumaphos 4.4 363.1 227.1 307.1 +
57. Pyridaben 4.4 365.1 309.2 147.2 +
58. Propiconazole 4.4 342.0 159.0 69.2 +
59. Clofentezine 4.5 303.0 138.1 102.1 +
60. Spinosyn D (spinosad) 4.8 746.5 142.3 98.4 +
61. Spinosyn J (spinetoram) 4.8 748.5 142.3 98.3 +
62. Trifloxystrobin 4.9 409.2 186.1 145.1 +
63. Prallethrin 4.9 301.2 123.2 105.2 +
64. Pyrethrin II 5.2 373.1 161.1 133.2 +
65. Spinosyn L (spinetoram) 5.4 760.5 142.2 98.1 +
66. Piperonyl butoxide 5.7 356.3 177.2 119.2 +
67. Chlorpyrifos 5.8 349.9 198.0 97.1 +
68. Hexythiazox 5.9 353.1 228.1 168.1 +
69. Etoxazole 6.4 360.2 141.1 304.2 +
70. Spiromesifen 6.4 273.2 255.2 187.2 +
71. Pyrethrin I 6.6 329.2 161.2 105.2 +
72. Cyfluthrin (qualifier) 6.6 453.1 193.2 - +
73. Cyfluthrin 6.6 451.1 191.2 - +
74. Cypermethrin 6.8 433.1 191.0 416.0 +
75. (E)-Fenpyroximate 6.8 422.2 366.1 138.1 +
76. trans-Permethrin 7.4 408.3 183.2 355.1 +
77. cis-Permethrin 7.7 408.3 183.2 355.1 +
78. Avermectin B1a 7.7 890.5 305.4 567.4 +
79. Etofenprox 7.8 394.3 177.2 359.3 +
80. Bifenthrin 8.0 440.0 181.2 166.2 +
81. Acequinocyl (precursor ion 1) 9.3 402.3 343.2 189.0 +
82. Acequinocyl (precursor ion 2) 9.3 386.0 344.2 189.1 +
Column Raptor ARC-18 (cat.# 9314A12)
Dimensions: 100 mm x 2.1 mm ID
Particle Size: 2.7 µm
Pore Size: 90 Å
 
Guard Column: Raptor ARC-18 EXP guard column cartridge 5 mm, 2.1 mm ID, 2.7 µm (cat.# 9314A0252)
Temp.: 40 °C
Standard/Sample California pesticide standard #1 (cat.# 34124)
  California pesticide standard #2 (cat.# 34125)
  California pesticide standard #3 (cat.# 34126)
  California pesticide standard #4 (cat.# 34127)
  California pesticide standard #5 (cat.# 34128)
  California pesticide standard #6 (cat.# 34129)
  Dimethoate-d6 (cat.# 31988)
  Dichlorvos-d6 (cat.# 31987)
  Carbaryl-d7 (cat.# 31985)
  Diazinon-d10 (cat.# 31986)
  Atrazine-d5 (cat.# 31984)
  Diuron-d6 (cat.# 31989)
  Liuron-d6 (cat.# 31990)
  Aflatoxins standard (cat.# 34121)
  Ochratoxin A (cat.# 34122)
  Compounds not present in these mixes were obtained separately.
Diluent: 75:25 Acetonitrile:water
Conc.: 5-15 ng/mL (Expected concentration range in extract of brownie initially spiked at 100 ng/g.)
Inj. Vol.: 2 µL
Mobile Phase  
A: Water, 2 mM ammonium formate, 0.1% formic acid
B: Methanol, 2 mM ammonium formate, 0.1% formic acid
 
Time (min) Flow (mL/min) %A %B
0.00 0.5 95 5
1.5 0.5 35 65
8.5 0.5 5 95
9.5 0.5 0 100
10.5 0.5 0 100
10.6 0.5 95 5
12 0.5 95 5
Detector MS/MS
Ion Mode: ESI+/ESI-
Mode: MRM
Instrument UHPLC
Sample Preparation Brownies were pulverized using a SPEX Freezer/Mill grinder and 0.5 g samples were fortified with pesticides and mycotoxins at 100 ng/g. A mix of internal standards was added at 200 ng/g. 1.5 mL of acetonitrile acidified with 1% acetic acid was added to the sample. The sample was vortexed and sonicated for 5 min, and then the supernatant was passed through a 100 mg Resprep C18 SPE cartridge (cat.# 26030). An additional 1.5 mL of extraction solvent (acidified acetonitrile) was added to the sample pellet, and then the sample was vortexed again. The supernatant was passed through the same C18 cartridge. 750 µL of extract was mixed with 250 µL of water, and then centrifuged for 5 min at low temperature (~7 ⁰C). 2 μL of final extract was injected into the LC-MS/MS system.
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Figura 2: Analisi GC MS/MS di pesticidi e micotossine nei brownie alla cannabis.

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GC_GN1206
  Peaks tR (min) Polarity Precursor Ion Product Ion Transition Type
1. Atrazine-D5 7.5 Positive 220.0 58.0 Quantifier
2. Atrazine-D5 7.5 Positive 205.0 127.0 Qualifier
3. Quintozene 7.8 Positive 294.9 236.9 Quantifier
4. Quintozene 7.8 Positive 236.8 118.9 Qualifier
5. Methyl parathion 8.2 Positive 263.0 109.0 Quantifier
6. Methyl parathion 8.2 Positive 263.0 79.0 Qualifier
7. Captan 9.1 Positive 184.0 149.1 Quantifier
8. Captan 9.1 Positive 184.0 134.1 Qualifier
9. trans-Chlordane 9.1 Positive 271.9 237.0 Quantifier
10. trans-Chlordane 9.1 Positive 372.9 265.9 Qualifier
11. cis-Chlordane 9.3 Positive 372.9 265.9 Quantifier
12. cis-Chlordane 9.3 Positive 271.9 237.0 Qualifier
13. Chlorfenapyr 9.5 Positive 247.1 227.1 Quantifier
14. Chlorfenapyr 9.5 Positive 59.1 31.1 Qualifier
15. Cyfluthrin 11.5 Positive 163.0 127.1 Quantifier
16. Cyfluthrin 11.5 Positive 199.1 170.1 Qualifier
17. Cypermethrin 11.7 Positive 163.0 127.1 Quantifier
18. Cypermethrin 11.7 Positive 181.1 152.1 Qualifier
Column Rxi-5ms, 30 m, 0.25 mm ID, 0.25 µm (cat.# 13423)
Standard/Sample California pesticide standard #1 (cat.# 34124)
  California pesticide standard #2 (cat.# 34125)
  California pesticide standard #3 (cat.# 34126)
  California pesticide standard #4 (cat.# 34127)
  California pesticide standard #5 (cat.# 34128)
  California pesticide standard #6 (cat.# 34129)
  Atrazine-d5 (cat.# 31984)
Diluent: Acetonitrile
Conc.: 5-7.5 ng/mL Expected concentration range in extract after extracting from brownie fortified at 100 ng/g (final extract was diluted in half with acetonitrile).
Injection
Inj. Vol.: 1 µL splitless
Liner: Topaz 4.0 mm ID single taper inlet liner w/wool (cat.# 23447)
Inj. Temp.: 250 °C
Purge Flow: 5 mL/min
Oven
Oven Temp.: 90 °C (hold 1 min) to 310 °C at 25 °C/min (hold 10 min)
Carrier Gas He, constant flow
Flow Rate: 1.4 mL/min
Detector MS/MS
Transfer Line Temp.: 290 °C
Analyzer Type: Quadrupole
Source Temp.: 330 °C
Electron Energy: 70 eV
Tune Type: PFTBA
Ionization Mode: EI
Instrument Thermo Scientific TSQ 8000 Triple Quadrupole GC-MS
Sample Preparation Brownies were pulverized using a SPEX Freezer/Mill grinder and 0.5 g samples were fortified with pesticides and mycotoxins at 100 ng/g. A mix of internal standards was added at 200 ng/g. 1.5 mL of acetonitrile acidified with 1% acetic acid was added to the sample. The sample was vortexed and sonicated for 5 min, then the supernatant was passed through a 100 mg Resprep SPE C18 cartridge (cat.# 26030). An additional 1.5 mL of extraction solvent (acidified acetonitrile) was added to the sample pellet, and the sample was vortexed again. The supernatant was passed through the same C18 cartridge. After reserving 750 μL for LC-MS analysis, the remaining supernatant was transferred to a Q-sep QuEChERS dSPE tube containing pre-weighed magnesium sulfate and PSA (cat.# 26215). After vortexing and centrifuging, 500 μL of extract was mixed with 500 μL of acidified acetonitrile. 1 μL of final extract was injected into the GC-MS/MS system.
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Considerazioni sullo sviluppo del metodo: ottimizzazione della preparazione del campione

Dato che la nostra lista di composti target comprende un’ampia gamma di analiti con polarità e caratteristiche fisiche e chimiche diverse, per la preparazione del campione è essenziale adottare una metodologia non selettiva e garantire inoltre l’efficace eliminazione delle maggiori interferenze senza alcuna perdita degli analiti target. Abbiamo utilizzato l'acetonitrile, il solvente di estrazione utilizzato tradizionalmente nei metodi QuEChERS, perché consente di recuperare una vasta gamma di composti polari e non polari. Inizialmente abbiamo condotto prove sperimentali utilizzando 1 g di campione e almeno 5 mL di acetonitrile per ogni estrazione. Tuttavia, riducendo la dimensione del campione a 0,5 g, siamo riusciti ad abbassare il volume del solvente di estrazione a 3 mL per ciascun campione, pur nel rispetto delle norme californiane. Contenere gli sprechi di solvente rende più ecologiche le pratiche analitiche adottate e consente di diminuire i costi associati all’analisi del campione e allo smaltimento dei rifiuti. Alla luce di questi vantaggi, per i successivi esperimenti di ottimizzazione sono stati utilizzati campioni da 0,5 g e acetonitrile come solvente di estrazione.

Tra tutti gli analiti target, il daminozide è uno dei più complicati ed è stato necessario adeguare ulteriormente la procedura di estrazione per l’analisi di questo pesticida. Il daminozide è altamente polare (log P = -1,5), quindi è difficile da estrarre completamente dalla matrice di brownie, e non viene trattenuto facilmente in condizioni di fase inversa. Inoltre, i composti a basso peso molecolare, quali il daminozide, sono più soggetti a interferenze e a un elevato rumore di fondo quando si utilizza MS, soprattutto in caso di scarsa ritenzione cromatografica. Sono state testate diverse strategie per aumentare il recupero di daminozide in condizioni che fossero favorevoli anche per gli altri analiti target.

L’acidificazione del solvente di estrazione è stato il primo parametro valutato. A tal fine abbiamo confrontato l’effetto derivante dell’utilizzo dell’acetonitrile con acido acetico (AA) all’1% (v/v) rispetto all’estrazione con acetonitrile puro. La Figura 3 mostra i risultati relativi ai composti target che hanno presentato una differenza di almeno il 40% tra i trattamenti. In caso di estrazione con acetonitrile acidificato, la risposta relativa del daminozide è aumentata di circa l’80%, mentre la spiroxamine e l’ochratoxin A hanno mostrato rispettivamente un miglioramento della risposta del 45% e 47%. Sulla scorta di quanto emerso e del fatto che nessuno dei composti target ha mostrato una diminuzione significativa della risposta, abbiamo utilizzato acetonitrile con acido acetico all'1% come solvente di estrazione nel nostro flusso di lavoro finale per la preparazione del campione. Ciò offre un ulteriore vantaggio in quanto l’acidificazione degli estratti previene la degradazione del captan, un pesticida adatto all’analisi GC-MS/MS che si degrada facilmente a valori di pH neutri o elevati [2].

Il secondo parametro per la preparazione del campione che abbiamo esaminato è stato l’utilizzo di un’unica estrazione da 3 mL rispetto a un’estrazione in due fasi (da 1,5 mL cadauna). La Figura 4 riassume i risultati relativi agli analiti che hanno mostrato differenze statistiche (test t, valore p <0,05 a un livello di confidenza del 95%) tra le due condizioni di estrazioni (in entrambi i casi è stato utilizzato acetonitrile acidificato). È interessante notare che il daminozide ha mostrato il miglioramento più significativo, con un aumento del 40% nella risposta relativa. Gli altri analiti indicati nella figura hanno mostrato un miglioramento della risposta tra il 10 e il 20%. L’aumento delle risposte relative qui riscontrato con l’utilizzo di una seconda fase di estrazione dovrebbe comportare recuperi di estrazione del campione più elevati in campioni reali. Dato che questo effetto dipende da analita, matrice e solvente di estrazione, si raccomanda di effettuare sempre una valutazione alle condizioni sperimentali desiderate.Dopo l’estrazione con acetonitrile acidificato tutti i campioni sono stati sottoposti a una semplice fase di purificazione con cartucce SPE C18 per rimuovere le interferenze idrofobiche più significative co-estratte dai brownie. Dopodiché, i campioni per l’analisi LC-MS/MS e GC-MS/MS sono stati trattati in modo diverso. I campioni LC-MS/MS sono stati diluiti in acqua e centrifugati, rendendo possibile la separazione dei lipidi rimanenti che non erano stati trattenuti nella cartuccia SPE in quanto meno solubili nell’estratto finale una volta aggiunta l’acqua. I campioni GC-MS/MS sono stati sottoposti a purificazione dSPE con solfato di magnesio e ammina primaria e secondaria (PSA) per rimuovere umidità e zuccheri prima dell’analisi. Si noti che la PSA può legarsi solo a pesticidi come il daminozide e la spiroxamine, quindi la procedura dSPE è stata condotta solo sui pesticidi soggetti a GC.

Figura 3: Effetto dell’acidificazione del solvente di estrazione (n=3). Le barre di errore rappresentano le deviazioni standard.

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Figura 4: Confronto tra le risposte relative corrispondenti all’estrazione in due fasi rispetto all’estrazione in fase singola (n=3).

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Considerazioni sullo sviluppo del metodo: minimizzazione degli effetti della matrice

È risaputo che la ionizzazione elettrospray è soggetta a effetti di soppressione/potenziamento causati da interferenze della matrice co-estratta. Questi problemi possono essere superati adeguando il metodo di preparazione del campione applicando condizioni più selettive, utilizzando uno standard interno idoneo e/o adeguando il metodo cromatografico per risolvere gli analiti derivanti da interferenze coeluenti. Per questo motivo, dopo aver selezionato le condizioni sperimentali per l’analisi di pesticidi e micotossine nei brownie alla cannabis è stata condotta una valutazione degli effetti assoluti della matrice secondo la metodologia proposta da Matuszewski et al. [3]. Per stimare gli effetti assoluti della matrice, sono stati messi a confronto il bianco della matrice e il solvente puro, entrambi fortificati alla medesima concentrazione (15 ppb), analizzando la risposta di tutti gli analiti target fortificati. Come illustrato nella Figura 5, solo il daminozide ha mostrato un deciso miglioramento della risposta. Considerando la scarsa ritenzione del daminozide alle condizioni di gradiente LC selezionate per questo studio, è probabile che questo pesticida coeluisca con le numerose interferenze non trattenute che sono presenti in genere in matrici come i brownie. In base a questi risultati, il daminozide-D6 è stato aggiunto al gruppo di standard interni per correggere in modo mirato eventuali variazioni collegate alla risposta del daminozide.

Figura 5: Effetti assoluti della matrice per pesticidi e micotossine soggetti a LC.

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Absolute matrix effect (%) is calculated as: (response of fortified sample extract/response of fortified solvent) x 100.

Oltre a indagare gli effetti assoluti della matrice, abbiamo valutato i recuperi assoluti di analiti alle condizioni del metodo finale. A tal fine, le risposte relative a estratti di brownie ottenuti da campioni fortificati a 100 ng/g (prima dell'estrazione) sono state confrontate con i bianchi della matrice di brownie successivamente fortificati (dopo l’estrazione) con la stessa quantità di analiti. Come mostrato nella Figura 6, senza considerare il daminozide, i recuperi più bassi di analiti (68%) sono stati riscontrati per la spiroxamine e l’ochratoxin A. Nonostante i numerosi tentativi di aumentare la risposta del daminozide è stato possibile recuperare solo il 30% della quantità addizionata inizialmente. Ciò dimostra che l’approccio migliore per ottenere risultati affidabili e accurati quando si analizzano pesticidi e micotossine nei brownie alla cannabis è utilizzare una matrice (bianco) surrogata per preparare diversi livelli di calibrazione e impiegare un analogo deuterato per il daminozide. L’utilizzo di calibratori preparati in solvente e l’assenza di adeguati standard interni potrebbero facilmente distorcere le misurazioni.

Figura 6: Recuperi assoluti di pesticidi e micotossine alle condizioni ottimizzate (n=3).

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Absolute analyte recovery (%) is calculated as: (response of fortified matrix sample/response of fortified sample extract) x 100.

Risultati della validazione del metodo

Le prestazioni del metodo nell'analisi di pesticidi e micotossine nei brownie alla cannabis sono state valutate in termini di linearità, accuratezza e precisione. Una sintesi dei risultati è riportata nella Tabella III.

Le curve di calibrazione sono state costruite mettendo a grafico il rapporto tra l’area dell’analita e quella dello standard interno rispetto alle concentrazioni di analiti in standard di matrice di brownie fortificati in un range di 5–700 ng/g. A tutte le curve di calibrazione è stato applicato un fattore di ponderazione di 1/x. La maggioranza dei composti ha mostrato un’eccellente linearità, come dimostrato dai valori R2 pari a ≥0,9990 (i valori variavano da 0,9939 a 0,9999).

L’accuratezza e la precisione sono state valutate a tre livelli di concentrazione selezionati per coprire il range lineare: basso (10 ng/g), medio (100 ng/g), e alto (500 ng/g). Sono stati ottenuti risultati eccellenti per tutti gli analiti target, perché l’utilizzo di standard preparati in matrice ha ridotto al minimo il potenziamento e la soppressione della matrice. I valori di recupero variavano dal 71,2% al 116% e i valori di RSD erano tutti inferiori al 25%, indicando un buon livello di accuratezza e precisione.

La maggioranza degli analiti ha mostrato valori di LOQ inferiori a 10 ng/g ed è stato dimostrato che la metodologia proposta consente la quantificazione di tutti i composti target a concentrazioni inferiori ai livelli di azione richiesti dallo stato della California per i prodotti a base di cannabis. Il ciflutrin e la cypermethrin hanno mostrato valori di LOQ inferiori in GC-MS/MS che non in LC-MS/MS, ma possono comunque essere analizzati ai livelli di azione richiesti con entrambi gli strumenti. Il valore di LOQ per ciascun composto è stato definito come la più bassa concentrazione con un rapporto segnale/rumore pari ad almeno 10, una differenza inferiore al 25% tra la concentrazione fortificata e la concentrazione stimata, e un valore di precisione delle repliche inferiore al 25%.

La stabilità dei composti target negli estratti LC dopo 24 e 48 ore di stoccaggio nell’autocampionatore a 10 ⁰C (n=4) è stata valutata relativamente alle intensità di picco di campioni preparati al momento (0 ore). La maggior parte dei composti ha mostrato un cambiamento nella risposta inferiore al 10% sull’intero periodo oggetto di studio.

Tabella III: Risultati di validazione per il metodo finale ottimizzato per l’analisi di pesticidi e micotossine nei brownie alla cannabis. I risultati sono stati determinati mediante analisi LC-MS/MS, fatta eccezione per i composti sottoposti ad analisi GC-MS/MS, come indicato.

Pesticide Action Level (ng/g) for Non-Inhalable Cannabis Goods LOQ (ng/g) R2 Low QC (10 ng/g) Medium QC (100 ng/g) High QC (500 ng/g)
Accuracy (%Recovery) Precision (%RSD) Accuracy (%Recovery) Precision (%RSD) Accuracy (%Recovery) Precision (%RSD)
Daminozide* <LOD 25 0.9954 102 11.7 92.1 9.73
Acephate 5000 10 0.9944 100 17.9 104 2.82 97.5 4.21
Thiamethoxam 4500 5 0.9979 102 9.77 106 1.04 103 2.14
Methomyl 100 5 0.9996 105 4.49 104 0.986 103 1.26
Oxamyl 200 5 0.9986 107 8.74 104 1.71 103 1.95
Imidacloprid 3000 10 0.9979 84.2 18.2 103 2.47 100 2.73
Dimethoate* <LOD 5 0.9994 103 4.58 101 2.72 101 3.93
Acetamiprid 5000 5 0.9991 105 7.26 103 1.00 100 2.52
Thiacloprid* <LOD 5 0.9993 101 6.48 106 2.90 100 2.19
Aldicarb* <LOD 5 0.9988 104 16.2 98.8 4.16 100 5.46
Naled 500 25 0.9962 105 9.83 103 1.37
Mevinphos I (79%)a* <LOD 4 0.9991 110 13.2 104 4.32 102 3.57
Mevinphos II (21%)b* <LOD 2 0.9981 109 24.0 106 5.58 98.3 5.71
Carbofuran* <LOD 5 0.9994 98.9 4.18 105 2.38 100 1.45
Carbaryl 500 5 0.9997 87.8 9.83 103 3.86 103 1.47
Dichlorvos* 100 5 0.9949 79.5 1.95 101 4.53 97.8 7.51
Propoxur* <LOD 5 0.9993 100 4.79 106 1.72 100 2.59
Chlorantraniliprole 40,000 10 0.9992 85.0 3.84 105 4.94 97.7 1.40
Imazalil* <LOD 5 0.9993 97.7 11.7 100 1.46 98.1 2.27
Metalaxyl 15,000 5 0.9996 101 8.15 103 4.11 101 2.40
Azoxystrobin 40,000 5 0.9998 102 3.39 103 0.635 102 1.04
Myclobutanil 9000 5 0.9997 102 5.95 104 4.07 100 2.89
Phosmet 200 5 0.9997 102 3.89 103 3.09 99.3 3.32
Spiroxamine* <LOD 5 0.9987 100 6.68 102 4.69 102 0.915
Fenoxycarb* <LOD 5 0.9995 99.2 2.37 103 2.24 100 2.06
Methiocarb* <LOD 5 0.9997 104 18.0 104 3.78 102 0.746
Spiromesifen 12,000 25 0.9994 103 5.12 101 3.39
Boscalid 10,000 5 0.9998 95.0 10.6 106 3.36 100 3.34
Paclobutrazol* <LOD 5 0.9996 97.3 13.1 103 2.94 97.2 3.49
Malathion 5000 5 0.9995 71.2 13.3 102 2.59 99.5 3.18
Dimethomorph I (39%)c 20,000** 4 0.9994 85.4 17.9 101 5.17 102 3.41
Dimethomorph II (61%)d 20,000** 3 0.9994 91.7 13.7 103 2.15 100 1.60
Tebuconazole 2000 5 0.9996 101 11.0 104 2.15 101 4.08
Bifenazate 5000 5 0.9999 111 6.58 104 1.97 100 3.58
Fenhexamid 10,000 10 0.9992 78.0 15.5 103 3.05 100 2.28
Propiconazole 20,000 5 0.9997 100 5.38 105 2.19 101 1.14
Spirotetramat 13,000 5 0.9990 101 13.8 104 2.04 101 4.28
Ethoprophos* <LOD 5 0.9997 110 8.84 103 1.76 99.5 2.17
Kresoxym-methyl 1000 5 0.9993 102 16.6 104 3.02 99.0 2.78
Spinosad- spinosyn A (71 %)e 3000** 3.5 0.9994 97.3 3.95 102 2.06 101 2.62
Diazinon 200 5 0.9995 103 3.29 101 2.93 101 2.20
Coumaphos* <LOD 5 0.9997 101 5.71 102 0.739 97.8 3.02
Clofentezine 500 5 0.9997 99.3 9.11 103 2.21 100 2.62
Spinosad - spinosyn D (29%)f 3000** 1.5 0.9990 103 9.75 101 4.37 97.1 4.99
Spinetoram - spinosyn J (80%)g 3000** 4 0.9991 102 7.14 105 1.79 100 2.58
Spinetoram - spinosyn L (20%)h 3000** 1 0.9991 97.8 4.45 100 3.53 99.1 1.15
Trifloxystrobin 30,000 5 0.9997 106 2.76 102 1.76 101 1.81
Prallethrin 400 25 0.9996 96.6 20.9 97.5 7.96 99.2 5.04
Hexythiazox 2000 5 0.9996 103 5.96 104 3.30 98.3 3.14
Cyfluthrin 1000 50 0.9988 107 6.81 102 10.5
Pyrethrin I (54%)i 1000** 5.4 0.9998 92.5 9.14 104 1.91 99.2 1.65
Pyrethrin II (34%)j 1000** 26 0.9990 100 10.9 98.7 3.44
Etoxazole 1500 5 0.9998 102 5.82 102 1.09 100 1.46
Piperonyl butoxide 8000 5 0.9998 103 4.56 103 2.45 101 3.43
Chlorpyrifos* <LOD 5 0.9994 98.0 10.2 101 3.69 100 1.93
Permethrin-cis (41%)k 20,000** 4.1 0.9994 92.5 10.8 105 3.69 99.3 3.87
Permethrin-trans (59%)l 20,000** 5.9 0.9999 116 5.48 106 3.61 97.4 2.75
Fenpyroximate 2000 5 0.9998 101 6.74 103 4.08 100 3.35
Bifenthrin 500 5 0.9994 107 2.93 103 4.98 101 2.07
AbamectinB1a 300 10 0.9999 84.9 20.1 105 6.26 101 3.99
Cypermethrin 1000 25 0.9991 93.3 6.76 98.8 7.62
Etofenprox* <LOD 5 0.9995 96.2 7.96 107 2.03 101 2.78
Pyridaben 3000 10 0.9989 105 20.7 101 5.39 100 2.48
Acequinocyl 4000 5 0.9987 91.1 11.0 103 5.47 104 4.81
Flonicamid 2000 10 0.9993 89.6 18.3 101 3.62 101 3.15
Fipronil* <LOD 10 0.9993 100 19.5 102 4.64 97.8 4.58
Fludioxonil 30,000 5 0.9995 109 11.6 104 6.13 99.3 3.39
Aflatoxin G2 20** 5 0.9987 102 19.1 104 2.74
Aflatoxin G1 20** 5 0.9984 116 11.2 96.4 1.20
Aflatoxin B2 20** 5 0.9996 105 10.4 98.7 1.77
Ochratoxin A 20 10 0.9943 91.1 11.5 112 10.6
Aflatoxin B1 20** 5 0.9990 106 11.4 96.0 3.23
Captan 5000 10 0.9941 112 14.8 103 5.25 108 5.28
Chlordane* <LOD 25 0.9939 106 5.32 93.6 4.60
Chlorfenapyr* <LOD 25 0.9953 102 3.19 99.2 4.95
Methyl parathion* <LOD 5 0.9976 103 6.59 103 1.83 92.7 5.22
Pentachloronitrobenzene 200 5 0.9975 98.2 9.75 103 3.76 100 4.45
Cyfluthrin 1000 5 0.9983 108 9.27 103 4.10 103 3.26
Cypermethrin 1000 10 0.9986 103 12.3 103 2.13 102 1.97

Reported results were determined by GC-MS/MS.
*Category I pesticides, LOQ is ≤100 ng/g
**Action level is the total concentration of both isomers together.
Results are calculated based on relative contribution of each isomer to the overall fortification levels as follows:
aMevinphos I: low: 8 ng/g; medium: 79 ng/g; high: 395 ng/g
bMenvinphos II: low: 2 ng/g; medium: 21 ng/g; high: 105 ng/g
cDimethomorph I: low: 4 ng/g; medium: 39 ng/g; high: 195 ng/g
dDimethomorph II: low: 6 ng/g; medium: 61 ng/g; high: 305 ng/g
eSpinosad- spinosyn A: low: 7 ng/g; medium: 71 ng/g; high: 355 ng/g
fSpinosad - spinosyn D: low: 3 ng/g; medium: 29 ng/g; high: 145 ng/g
gSpinetoram - spinosyn J: low: 8 ng/g; medium: 80 ng/g; high: 400 ng/g
hSpinetoram - spinosyn L: low: 2 ng/g; medium: 20 ng/g; high: 100 ng/g
iPyrethrin I: low: 5 ng/g; medium: 54 ng/g; high: 270 ng/g
jPyrethrin II: low: 3 ng/g; medium: 34 ng/g; high: 170 ng/g
kPermethrin-cis: low: 4 ng/g; medium: 41 ng/g; high: 205 ng/g
lPermethrin-trans: low: 6 ng/g; medium: 59 ng/g; high: 295 ng/g

Conclusioni

È stato sviluppato un flusso di lavoro efficace per l'analisi di pesticidi e micotossine in brownie alla cannabis e sono state illustrate in dettaglio le strategie di ottimizzazione volte a fornire un punto di partenza per matrici simili. Tutti i composti soggetti ad analisi LC-MS/MS e GC-MS/MS sono stati estratti impiegando acetonitrile acidificato e successivamente purificati utilizzando cartucce SPE C18. Per i campioni GC-MS/MS è stato necessario effettuare una purificazione dSPE supplementare con solfato di magnesio e PSA. L’utilizzo di acetonitrile acidificato si è dimostrato cruciale nel recupero di analiti quali daminozide, spiroxamine e ochratoxin A. Tutti i composti target hanno restituito risultati eccellenti in termini di valori di LOQ, linearità, accuratezza e precisione. Questa metodologia prevede l’utilizzo di soli 3 mL di solvente di estrazione per ciascun campione, consentendo quindi anche di ridurre significativamente l’utilizzo/lo spreco di solvente. Gli estratti hanno presentato una stabilità accettabile anche dopo 48 ore nell’autocampionatore LC.

Bibliografia

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  3. B. K. Matuszewski, M. L. Constanzer, C. M. Chavez-Eng, Strategies for the assessment of matrix effect in quantitative bioanalytical methods based on HPLC−MS/MS, Anal. Chem. 75 (2003) 3019–3030. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/ac020361s
FFAN3149-IT