L’analisi di pesticidi, micotossine e cannabinoidi nelle caramelle gommose alla cannabis

Abstract

Lo stato della California richiede l’analisi di pesticidi, micotossine e cannabinoidi in tutti i tipi di prodotti derivati dalla cannabis [1]. Per questo motivo è fondamentale sviluppare flussi di lavoro affidabili che consentano di determinare facilmente tali analiti in diverse matrici. Le caramelle gommose alla cannabis sono un prodotto alimentare molto diffuso, la cui composizione le rende una matrice altamente complessa. In questo studio illustreremo un flusso di lavoro completo, che utilizza un’unica procedura di estrazione, per l’analisi nelle caramelle gommose dei pesticidi, delle micotossine e dei cannabinoidi indicati dal governo californiano.

Introduzione

I prodotti alimentari arricchiti di cannabis o cannabidiolo (CBD) sono sempre più diffusi fra i consumatori di cannabis. In ambito analitico, è obbligatorio eseguire analisi di potenza dei prodotti alimentari in tutti gli Stati che richiedono per legge le analisi di laboratorio. Inoltre, lo stato della California prevede anche la determinazione di contaminanti, come pesticidi e micotossine, negli alimenti e in altri tipi di prodotti derivati dalla cannabis. Data l’ampia varietà di prodotti alimentari disponibili in commercio, per ottenere dati affidabili per tutti gli analiti di interesse e in qualsiasi tipo di matrice è necessario adottare strategie analitiche differenti. Fra i vari tipi di prodotti alimentari a base di cannabis, le caramelle gommose rappresentano una grande sfida per i laboratori di analisi;

si tratta di una matrice “appiccicosa” composta in genere da zucchero, amido, pectina e gelatina. Data la composizione del campione, le strategie di preparazione per l’analisi di potenza solitamente prevedono una fase di solubilizzazione in solventi come acqua o DMSO, oppure, in alternativa, si possono utilizzare grandi volumi di solventi come il metanolo. Una volta omogenizzato il campione, i cannabinoidi vengono quantificati tramite HPLC-UV iniettando l’estratto diluito direttamente oppure dopo una fase di salting-out eseguita con i sali QuEChERS. Esistono poche informazioni di dominio pubblico relative all’analisi di contaminanti come pesticidi e micotossine in matrici di caramelle gommose; è infatti disponibile un solo report che illustra i dati semi-quantitativi di 35 pesticidi utilizzando i QuEChERS [2].

In questo studio delineiamo un flusso di lavoro affidabile per la determinazione quantitativa nei campioni di caramelle gommose di pesticidi, micotossine e cannabinoidi presenti nell'elenco stilato dal governo californiano. La metodologia ottimizzata di preparazione prevede la solubilizzazione del campione, seguita da una fase di estrazione con acetonitrile acidificato e un passaggio di salting-out per il quale si utilizzano i sali QuEChERS per EN. Per l’analisi di cannabinoidi e contaminanti compatibili con la LC è stata condotta una diluizione semplice prima dell’iniezione, mentre per i pesticidi analizzabili in GC, prima dell’analisi, è stato necessario utilizzare una miscela di sorbente dSPE contenente ammine primarie/secondarie (PSA), nero di carbonio grafitato (GCB) e solfato di magnesio. Nel complesso, il flusso di lavoro proposto per l’analisi di pesticidi, micotossine e cannabinoidi nelle caramelle gommose alla cannabis ha fornito risultati soddisfacenti in termini di linearità, accuratezza, precisione e limiti di quantificazione (LOQ).

Studio sperimentale

Preparazione del campione

A valle dei test preliminari sui vari parametri sperimentali è stato implementato il seguente flusso di lavoro (Figura 1). È stato pesato 1 g di caramelle tritate in una provetta da 50 mL (cat.# 25846) e sono stati aggiunti 5 mL di acqua. I campioni sono stati poi vortexati con forza finché i pezzi di caramella si sono solubilizzati. La soluzione del campione è stata poi adeguatamente fortificata con analiti target e/o standard interni (gli standard interni sono stati utilizzati solo per l’analisi dei contaminanti e non per l’analisi di potenza). Dopodiché il tutto è stato vortexato per ulteriori 30 secondi. A seguire, sono stati aggiunti 5 mL di acetonitrile acidificato con acido acetico (1% v:v) e i campioni sono stati nuovamente vortexati per 30 secondi. È stato aggiunto un pacchetto di sali di estrazione Q-sep QuEChERS per la norma europea EN 15662 (cat.# 25849), poi il campione è stato passato nuovamente al vortex e centrifugato per 5 minuti.

Per l’analisi di potenza sono stati miscelati 100 µL di estratto del campione e 900 µL di 25:75 acqua:acetonitrile, mentre 2 µL sono stati analizzati in LC-UV. Per quanto riguarda i contaminanti compatibili con la LC, sono stati miscelati 750 µL di estratto del campione e 250 µL di acqua, mentre 2 μL sono stati analizzati in LC-MS/MS. Sul fronte invece dei contaminanti analizzabili in GC, sono stati trasferiti 1,9 mL di estratto in una provetta dSPE Q-sep QuEChERS contenente sorbenti pre-pesati di PSA, GCB e solfato di magnesio (cat.# 26217). Dopo il passaggio al vortex e la centrifuga sono stati miscelati 500 μL di estratto con 500 μL di 1% di acido acetico in acetonitrile, mentre 1 μL è stato analizzato in GC-MS/MS.

Quantificazione

Ai fini delle analisi di pesticidi e micotossine, le soluzioni di calibrazione sono state preparate fortificando con analiti e standard interni le aliquote dell’estratto ottenuto da campioni bianchi di caramelle gommose (è stato ottenuto un estratto misto miscelando gli estratti di vari campioni bianchi di caramelle gommose). La Tabella I mostra il volume della soluzione di spiking con analiti target e della soluzione della miscela di standard interni aggiunto a ciascuna aliquota (volume della soluzione di calibrazione finale = 3 mL). Per costruire le curve di calibrazione dei pesticidi analizzabili in GC, 1,9 mL dei 3 mL delle soluzioni di calibrazione sono stati sottoposti a purificazione dSPE, come descritto nella sezione dedicata alla preparazione del campione. L’accuratezza e la precisione del metodo sono state valutate fortificando in quadruplicato le caramelle gommose omogeneizzate a 10, 50, 100 e 500 ng/g, dopo l’aggiunta di acqua e il passaggio al vortex (Tabella II), e seguendo tutto il flusso di lavoro di preparazione del campione descritto nella sezione dedicata.

Per l’analisi dei cannabinoidi sono state preparate soluzioni di calibrazione a 2, 5, 10, 20, 50, 100 e 200 ppm in 75:25 acetonitrile:acqua. È stato valutato il recupero dei cannabinoidi fortificando campioni di 1 g di caramelle gommose solubilizzate in acqua a 0,2 e 0,5 mg/g (n=2), procedendo poi all’estrazione come descritto sopra.

Tabella I: Preparazione dei calibratori per l’analisi di pesticidi e micotossine con l’utilizzo di aliquote di estratti ottenuti da campioni bianchi di caramelle gommose (volume finale di ciascuna soluzione di calibrazione = 3 mL).

Analiti desiderati Conc. nella matrice (ng/g)	Conc. dell’analita nell’estratto finale ipotizzando un recupero del 100% dalla matrice (ng/mL)	µL di soluzione di analiti target addizionati nell'estratto bianco	Conc. dell’analita nella soluzione di spiking (ng/mL)	µL di 5000 ng/mL di miscela di standard interno aggiunti all’estratto bianco
5	1	30	100	24
20	4	12	1000	24
50	10	30	1000	24
75	15	45	1000	24
150	30	90	1000	24
200	40	24	5000	24
400	80	48	5000	24
700	140	84	5000	24

Tabella II: Fortificazione di micotossine e pesticidi nelle caramelle gommose (1 g di campione omogeneizzato con 5 mL di acqua) a diversi livelli di concentrazione..

Conc. nella matrice (ng/g)	µL di soluzione di analiti target addizionati nei campioni omogeneizzati in acqua	Conc. dell’analita nella soluzione di spiking (ng/mL)	µL di 5000 ng/mL di miscela di standard interno aggiunti a campioni omogeneizzati in acqua
10	10	1000	40
50	50	1000	40
100	100	1000	40
500	100	5000	40

Parametri dello strumento

La strumentazione e le condizioni per l'analisi di pesticidi, micotossine e cannabinoidi nelle caramelle di cannabis sono presentate nelle tabelle III, IV e V. Le transizioni ioniche per i contaminanti ammessi alla LC e alla GC sono presentate rispettivamente nelle tabelle VI e VII. I tempi di ritenzione dei cannabinoidi sono riportati nella Tabella VIII.

Tabella III: Condizioni LC-MS/MS (pesticidi e micotossine).

Colonna	Raptor ARC-18 2.7 µm, 100 mm x 2.1 mm (cat.# 9314A12)
Precolonna	Cartuccia per precolonna Raptor ARC-18 EXP 2,7 µm, 5 x 2,1 mm (cat.# 9314A0252)
Fase mobile A	Acqua, formato di ammonio 2 mM, acido formico 0,1%
Fase mobile B	Metanolo, formato di ammonio 2 mM, acido formico 0,1%
Scansione temporale	Tempo (min.)	%B	Tempo (min.)	%B
	0	5	10.5	100
	1.5	65	10.6	5
	8.5	95	12.0	5
	9.5	100	-	-
Flusso	0.5 mL/min
Temp. colonna	40 °C
Temp. autocampionatore	10 °C
Volume di iniezione	2 μL
Strumento	Shimadzu LCMS-8060

Tabella IV: Condizioni GC-MS/MS (pesticidi).

Strumento	Thermo Trace 1310-TSQ 8000
Colonna:	Rxi-5ms, 30 m x 0.25 mm ID x 0.25 µm, (cat.# 13423)
Modalità di iniezione	Splitless
Vol. iniezione	1 µL
Liner	Topaz a cono singolo con ID 4,0 mm con lana (cat.# 23447)
Temp. iniez.	250 °C
Flusso split	14.0 mL/min
Tempo splitless	0.50 min
Flusso di spurgo	5 mL/min
Forno	90 °C (mantenimento 1 min.) fino a 310 °C a 25 °C/min (mantenimento 10 min.)
Carrier Gas	He, flusso costante
Velocità flusso	1.40 mL/min
Detector	MS/MS
Tipo di metodo	Acquisizione - a tempo
Modalità di ionizzazione	EI
Temp. linea di trasferimento	290 °C
Temp. sorgente	330 °C

Tabella V: Condizioni HPLC-UV (analisi di potenza con un metodo a risparmio di solvente [3]).

Strumento	Waters ACQUITY
Colonna:	Raptor ARC-18 2.7 µm, 150 mm x 2.1 mm (cat.# 9314A62)
Precolonna	Cartuccia per precolonna Raptor ARC-18 EXP 2,7 µm, 5 x 2,1 mm (cat.# 9314A0252)
Vol. iniezione	2 µL
Fase mobile A	Acqua, formato di ammonio 5 mM, acido formico 0,1%
Fase mobile B	Acetonitrile, acido formico 0,1%
Gradiente	Isocratico, 75% B
Flusso	0.4 mL/min
Temp. Colonna	30 °C
Autosampler Temp.	10 °C
Lunghezza d’onda	228 nm

Tabella VI: Transizioni LC-MS/MS

Nome	Tempo di ritenzione (min.)	Ione precursore	Ione prodotto 1	Product Ion 2
Daminozide-D6	0.7	167.0	149.3	49.3
Daminozide	0.7	161.1	44.1	143.2
Acephate	1.7	184.0	143.1	95.1
Oxamyl	2.0	237.1	72.1	90.1
Flonicamid	2.1	230.1	203.1	174.1
Methomyl	2.1	163.1	88.1	106.1
Thiamethoxam	2.1	292.0	211.1	181.1
Imidacloprid	2.3	256.1	209.1	175.1
Mevinphos	2.4	225.1	127.1	193.2
Acetamiprid	2.4	223.0	126.1	56.1
Dimethoathe-D6	2.4	236.1	205.1	-
Dimethoate	2.4	230.0	199.1	125.1
Thiacloprid	2.5	253.0	126.0	90.1
Aflatoxin G2	2.5	331.2	189.3	115.2
Aflatoxin G1	2.5	329.2	243.2	215.3
Aldicarb	2.6	116.0	89.2	70.2
Aflatoxin B2	2.6	315.3	287.2	243.3
Dichlorvos	2.7	220.9	109.1	79.2
Dichlorvos-D6	2.7	227.0	115.1	-
Aflatoxin B1	2.7	313.2	241.2	128.2
Imazalil	2.7	297.0	159.0	201.0
Carbofuran	2.7	222.1	123.1	165.2
Propoxur	2.7	210.1	111.1	93.1
Carbaryl-D7	2.8	209.2	152.2	-
Carbaryl	2.8	202.1	145.1	127.1
Diuron-D6	3.0	239.1	78.2	-
Atrazine-D5	3.0	221.2	179.1	-
Naled	3.1	397.8	127.1	109.1
Metalaxyl	3.1	280.2	220.2	192.2
Spiroxamine	3.1	298.3	144.2	100.2
Chlorantraniliprole	3.2	483.9	452.9	285.9
Phosmet	3.2	318.0	160.1	77.2
Azoxystrobin	3.3	404.0	372.1	344.1
Linuron-D6	3.3	255.1	160.1	-
Fludioxonil*	3.4	247.0	180.0	126.0
Methiocarb	3.4	226.1	169.1	121.1
Dimethomorph	3.5	388.2	301.2	165.3
Boscalid	3.5	342.9	307.1	140.1
Paclobutrazol	3.6	294.3	70.1	125.1
Malathion	3.6	331.0	127.2	285.2
Myclobutanil	3.7	289.1	70.1	125.1
Bifenazate	3.7	301.0	198.1	170.2
Ochratoxin A	3.8	404.2	239.1	358.3
Fenhexamid	3.9	302.1	97.1	55.2
Spirotetramat	4.0	374.2	302.1	216.1
Ethoprophos	4.1	243.1	131.1	97.1
Fipronil*	4.1	436.8	331.8	251.9
Fenoxycarb	4.2	302.1	88.1	116.1
Kresoxim methyl	4.4	314.2	267.2	222.2
Tebuconazole	4.4	308.1	70.1	125.1
Diazinon-D10	4.6	315.2	170.2	-
Spinosad (spinosyn A)	4.6	732.4	142.2	98.1
Diazinon	4.6	305.1	169.2	153.2
Coumaphos	4.7	363.1	227.1	307.1
Pyridaben	4.7	365.1	309.2	147.2
Propiconazole	4.7	342.0	159.0	69.2
Clofentezine	4.8	303.0	138.1	102.1
Spinosad (spinosyn D)	5.0	746.5	142.3	98.4
Spinetoram (spinosyn J)	5.1	748.5	142.3	98.3
Trifloxystrobin	5.3	409.2	186.1	145.1
Prallethrin	5.3	301.2	123.2	105.2
Pyrethrin II	5.5	373.1	161.1	133.2
Spinetoram (spinosyn L)	5.6	760.5	142.2	98.1
Piperonyl butoxide	6.0	356.3	177.2	119.2
Chlorpyrifos	6.1	349.9	198.0	97.1
Hexythiazox	6.2	353.1	228.1	168.1
Etoxazole	6.6	360.2	141.1	304.2
Spiromesifen	6.7	273.2	255.2	187.2
Pyrethrin I	6.9	329.2	161.2	105.2
Cyfluthrin (qualifier)	6.9	453.1	193.2	-
Cyfluthrin	6.9	451.1	191.2	-
Cypermethrin	7.1	433.1	191.0	416.0
(E)-Fenpyroximate	7.1	422.2	366.1	138.1
Permethrin-trans	7.6	408.3	183.2	355.1
Permethrin-cis	7.9	408.3	183.2	355.1
Avermectin B1a	7.9	890.5	305.4	567.4
Etofenprox	8.0	394.3	177.2	359.3
Bifenthrin	8.2	440.0	181.2	166.2
Acequinocyl precursor ion 1	9.4	402.3	343.2	189.0
Acequinocyl precursor ion 2	9.4	386.0	344.2	189.1

* Analizzati in modalità negativa.

Tabella VII: Transizioni GC-MS/MS.

Nome	Tempo di ritenzione (min.)	Polarità ionica	Ione precursore	Ione prodotto
Atrazine-D5 (IS) (Quan)	6.82	Positive	220.0	58.0
Atrazine-D5 (IS) (Qual)	6.82	Positive	205.0	127.0
Diazinon-D10 (Quan)	7.01	Positive	183.0	139.0
Diazinon-D10 (Qual)	7.01	Positive	183.0	168.0
Quintozene (PCNB) (Quan)	7.03	Positive	294.9	236.9
Quintozene (PCNB) (Qual)	7.03	Positive	236.8	118.9
Methyl parathion (Quan)	7.50	Positive	263.0	109.0
Methyl parathion (Qual)	7.50	Positive	263.0	79.0
Captan (Quan)	8.37	Positive	184.0	149.1
Captan (Qual)	8.37	Positive	184.0	134.1
trans-Chlordane (Quan)	8.41	Positive	271.9	237.0
trans-Chlordane (Qual)	8.41	Positive	372.9	265.9
cis-Chlordane (Quan)	8.53	Positive	372.9	265.9
cis-Chlordane (Qual)	8.53	Positive	271.9	237.0
Chlorfenapyr (Quan)	8.80	Positive	247.1	227.1
Chlorfenapyr (Qual)	8.80	Positive	59.1	31.1
Cyfluthrin (Quan)	10.61	Positive	226.0	206.0
Cyfluthrin (Qual)	10.61	Positive	163.0	127.0
Cypermethrin (Quan)	10.87	Positive	163.0	127.1
Cypermethrin (Qual)	10.87	Positive	181.1	152.1

Tabella VIII: Tempi di ritenzione dei cannabinoidi..

Composto	Tempo di ritenzione (min.)
Cannabidiolic acid (CBDA)	2.142
Cannabigerol (CBG)	2.405
Cannabidiol (CBD)	2.535
Cannabinol (CBN)	3.776
Delta-9-tetrahydrocannabinol (Delta-9-THC)	4.753
Tetrahydrocannabinolic acid (THCA)	6.279

Risultati e discussione

Ottimizzazione del metodo

La varietà delle matrici di cannabis e le caratteristiche chimiche differenti degli analiti target impongono l’adozione di strategie diversificate per ottenere risultati accurati. L’analisi di pesticidi, micotossine e cannabinoidi nelle caramelle gommose alla cannabis, come previsto dallo stato della California, richiede condizioni sperimentali totalmente diverse rispetto a quelle adottate per i brownie nel nostro precedente articolo tecnico [4]. Innanzitutto, abbiamo constatato che trattare le caramelle gommose polverizzate (tritate con ghiaccio secco e un robot da cucina) può sollevare problematiche complesse perché la matrice, una volta a temperatura ambiente, diventa molto appiccicosa. Per questo motivo si è rivelata un’alternativa decisamente migliore tagliare le caramelle gommose in piccoli pezzi, in modo da riuscire a manipolarle più facilmente quando si pesano le quantità necessarie di campione.

La sfida successiva è stata quella di individuare l’approccio migliore per dissolvere la matrice prima dell’estrazione e ottenere così risultati affidabili. Poiché il campione è stato tritato in piccoli pezzi di dimensione casuale, avere una matrice omogenea è stato fondamentale per garantire una riproducibilità del metodo soddisfacente. In primo luogo, abbiamo valutato l’utilizzo di solventi come acetonitrile e metanolo per dissolvere i pezzi delle caramelle gommose ed estrarre gli analiti di interesse tramite una semplice estrazione di solvente. Tuttavia, abbiamo riscontrato grandi difficoltà nel solubilizzare la matrice in queste condizioni, quindi abbiamo valutato anche l’utilizzo di DMSO. Nonostante tutti i pezzi di caramelle gommose siano stati dissolti facilmente in questo solvente, il daminozide non è stato rilevato in nessuno degli estratti perché la piccola percentuale di DMSO rimasta nei campioni iniettati ha portato alla soppressione della ionizzazione. Dopo questi test, abbiamo concluso che il modo migliore per ottenere un campione omogeneo fosse idratare il campione con 5 mL di acqua e poi effettuare un vigoroso passaggio al vortex. Dopodiché, per estrarre tutti i contaminanti dalla matrice sono stati aggiunti al campione dissolto 5 mL di acetonitrile acidificato a 1% con acido acetico.

Ai fini della separazione dello strato organico da quello acquoso sono stati confrontati tre differenti sali di estrazione Q-sep QuEChERS: AOAC (cat.# 25851), senza tampone (cat.# 25847) ed EN (cat.# 25849). I sali EN hanno ottenuto le prestazioni migliori, mostrando recuperi superiori all’83% per tutti i composti a esclusione del daminozide e del suo analogo deuterato, che invece hanno raggiunto un recupero del 25%. Per quanto riguarda la fase di purificazione, è stato valutato l’effetto di quattro diverse miscele di sorbenti dSPE Q-sep QuEChERS (cat.# 26215, 26216, 26217, 26242) in tutti i pesticidi analizzabili in LC-MS. È stato confermato che tutte le miscele contenenti 25 mg di PSA (cat.#  26215, 26216, 26217) hanno provocato perdite significative di daminozide e di ocratossina A, con un recupero pari solo al 40% del quantitativo iniziale presente nella soluzione. La miscela dSPE contenente MgSO4 e C18 (cat.# 26242) non ha causato perdite significative di pesticidi, ma abbiamo deciso di valutare l’idoneità, per la quantificazione di analiti compatibili con la LC, dell’utilizzo dell’estratto organico senza alcuna ulteriore fase di purificazione.

Per valutare la fattibilità di un’analisi diretta degli estratti sono stati condotti esperimenti volti a studiare gli effetti assoluti della matrice negli estratti di caramelle senza alcuna fase di purificazione, utilizzando la metodologia proposta da Matuszweski et al. [5]. Gli estratti ottenuti dai campioni bianchi sono stati fortificati alle concentrazioni finali di 5, 15 e 50 ppb e tramite LC-MS/MS sono state confrontate le loro risposte con quelle del solvente puro, fortificato agli stessi livelli di concentrazione. A 5 ppb, 12 pesticidi hanno mostrato effetti di matrice superiori al 120%, mentre a 15 ppb e 50 ppb solo il daminozide è risultato potenziato in modo significativo (Tabella IX). Considerando questo e lo scarso recupero di daminozide, utilizzare il daminozide-d6 come standard interno è stato fondamentale per riuscire a ottenere dati affidabili.

Per quanto riguarda i recuperi dei pesticidi analizzabili in GC, i dati relativi alla valutazione di tre miscele di sorbenti dSPE (cat.# 26215, 26216, e 26217) hanno mostrato che, mettendo a confronto le risposte dell’estratto purificato e quelle dell’estratto originale, in tutti i casi i recuperi sono stati superiori al 96%. Dato l’alto contenuto di zucchero e pigmenti negli estratti di caramelle gommose, per la procedura finale per la preparazione del campione è stato scelto il sorbente dSPE contenente PSA, GCB e solfato di magnesio (cat.# 26217).

Verifica del metodo

La Tabella X mostra i risultati quanto a limiti di quantificazione, linearità, accuratezza e precisione relativi a pesticidi e micotossine presenti nella lista stilata dal governo della California, determinati nella matrice di caramelle gommose. Per tutti i contaminanti analizzati in LC-MS/MS, le curve di calibrazione sono state tracciate utilizzando i rapporti delle risposte degli analiti e degli standard interni e un fattore di ponderazione di 1/x. In riferimento agli analiti analizzabili in GC, solo la curva di calibrazione del PCNB è stata elaborata con il rapporto analita/standard interno, avendo come standard interno il diazinone-d10. La quantificazione per i restanti composti compatibili con la GC è stata effettuata con curve di calibrazione esterne (area vs. concentrazione fortificata) perché in questo modo si sono ottenuti risultati migliori rispetto al procedimento con gli standard interni. Sono stati ottenuti valori di RSD inferiori al 24% per tutti gli analiti e a tutti i livelli di concentrazione testati. I valori di accuratezza riscontrati sono stati fra il 75 e il 118%, mentre i coefficienti di determinazione (R2) erano tutti superiori a 0,99.

Infine, i risultati delle analisi dei cannabinoidi hanno dimostrato che l’estratto ottenuto per la determinazione dei contaminanti è adatto anche per l’analisi di potenza. La Tabella XI mostra i dati relativi alle curve di calibrazione preparate in solvente per la quantificazione di ciascun cannabinoide. Come illustrato nella Tabella XII, i campioni di caramelle gommose fortificati con sei cannabinoidi a 0,2 mg/g hanno mostrato recuperi fra il 99% e il 107%, mentre i campioni fortificati a 0,5 mg/g hanno avuto recuperi fra il 99% e il 106%; le Figure da 2 a 4 riportano i rispettivi cromatogrammi.

Tabella IX: Effetti assoluti della matrice (ME) per pesticidi e micotossine nelle caramelle gommose alla cannabis.

	ME at 5 ppb (%)	RSD	ME at 15 ppb (%)	RSD	ME at 50 ppb (%)	RSD
Daminozide	216	3	251	7	185	3
Acephate	95	6	85	1	89	6
Oxamyl	105	5	96	2	98	5
Flonicamid	91	32	90	22	97	17
Methomyl	104	4	92	3	99	4
Thiamethoxam	105	5	92	5	96	5
Imidacloprid	114	9	87	9	100	9
Mevinphos	102	6	93	3	93	6
Acetamiprid	100	2	88	0	91	2
Dimethoate	97	3	92	3	93	3
Thiacloprid	109	7	93	1	93	7
Aflatoxin G2	102	6	86	0	93	6
Aflatoxin G1	106	7	93	1	91	7
Aldicarb	81	22	85	14	90	22
Aflatoxin B2	113	11	79	9	95	11
Dichlorvos	126	15	90	6	92	15
Aflatoxin B1	104	9	93	5	95	9
Imazalil	92	1	96	3	98	1
Carbofuran	106	3	98	1	102	3
Propoxur	104	3	96	4	96	3
Carbaryl	103	4	99	8	93	4
Naled	101	4	94	2	84	4
Metalaxyl	105	3	97	2	97	3
Spiroxamine	105	4	94	1	97	4
Chlorantraniliprole	114	6	88	5	100	6
Phosmet	108	10	100	6	92	10
Azoxystrobin	104	1	94	1	94	1
Fludioxonil	101	7	90	11	94	7
Methiocarb	102	5	94	3	95	5
Dimethomorph	108	15	93	0	93	15
Boscalid	119	11	94	4	85	11
Paclobutrazol	110	10	90	2	92	10
Malathion	101	3	92	4	95	3
Myclobutanil	92	11	93	0	95	11
Bifenazate	105	2	98	4	99	2
Ochratoxin A	111	10	111	0	98	10
Fenhexamid	135	6	102	0	91	6
Spirotetramat	107	7	87	5	95	7
Ethoprophos	104	5	97	2	96	5
Fipronil	99	12	93	9	96	12
Fenoxycarb	108	9	97	1	93	9
Kresoxim methyl	93	21	108	3	90	21
Tebuconazole	102	6	95	3	97	6
Spinosyn A	100	5	98	2	95	5
Diazinon	107	2	95	1	96	2
Coumaphos	114	7	94	3	97	7
Pyridaben	139	18	103	15	94	18
Propiconazole	106	2	97	1	95	2
Clofentezine	126	14	87	3	92	14
Spinosyn D	104	8	93	8	97	8
Spinosyn J	110	6	92	6	101	6
Trifloxystrobin	103	2	95	2	101	2
Prallethrin	101	17	103	0	98	17
Pyrethrin II	92	23	82	5	101	23
Spinosyn L	106	6	95	0	98	6
Piperonyl butoxide	103	2	97	0	96	2
Chlorpyrifos	105	10	93	0	91	10
Hexythiazox	121	15	96	0	86	15
Etoxazole	102	1	95	1	95	1
Spiromesifen	112	6	95	5	100	6
Pyrethrin I	131	13	97	4	95	13
Cyfluthrin	-	-	-	-	80	8
Cypermethrin	-	-	95	16	96	16
(E)-Fenpyroximate	107	6	95	4	94	6
Permethrin-trans	136	22	103	4	94	22
Permethrin-cis	113	12	98	8	101	12
Avermectin B1a	122	17	96	0	87	17
Etofenprox	110	4	100	2	101	4
Bifenthrin	135	5	98	6	85	5
Acequinocyl	129	5	95	5	78	5

Tabella X: Limiti di quantificazione (LOQ), linearità, accuratezza e precisione per pesticidi e micotossine nelle caramelle gommose alla cannabis.

Contaminante	Livello di azione (ng/g)	LOQ (ng/g)	R2	10 ng/g (n=4)		50 ng/g (n=4)		100 ng/g (n=4)		500 ng/g (n=4)
				Accuratezza (%)	Precisione (RSD)	Accuratezza (%)	Precisione (RSD)	Accuratezza (%)	Precisione (RSD)	Accuratezza (%)	Precisione (RSD)
Daminozide*	<LOD	20	0.9999	-	-	114	6	114	4	116	4
Acephate	5000	5	0.9996	100	4	93	3	90	2	88	2
Oxamyl	200	5	0.999	108	1	102	3	105	4	99	3
Flonicamid	2000	50	0.999	-	-	117	6	105	11	101	4
Methomyl	100	20	0.9989	-	-	102	3	103	3	100	1
Thiamethoxam	4500	10	0.9988	112	23	108	5	108	6	100	3
Imidacloprid	3000	10	0.9985	105	17	107	3	109	4	102	5
Mevinphos (I and II)*	<LOD	20	0.9981	-	-	101	4	104	7	101	3
Acetamiprid	5000	10	0.9968	100	8	108	6	109	5	105	1
Dimethoate*	<LOD	5	0.9994	109	15	104	3	101	5	99	2
Thiacloprid*	<LOD	20	0.9981	-	-	100	1	103	4	103	3
Aflatoxin G2	20#	5	0.9957	112	17	101	6	97	2	-	-
Aflatoxin G1	20#	5	0.9984	114	9	98	1	100	4	-	-
Aldicarb*	<LOD	20	0.9971	-	-	91	17	104	8	97	4
Aflatoxin B2	20#	5	0.9973	97	23	107	6	94	7	-	-
Dichlorvos*	<LOD	10	0.9984	98	17	103	4	97	18	106	4
Aflatoxin B1	20#	5	0.9978	113	5	101	6	96	5	-	-
Imazalil*	<LOD	5	0.9977	97	19	109	5	107	4	105	3
Carbofuran*	<LOD	5	0.9973	93	7	108	1	109	5	99	4
Propoxur*	<LOD	5	0.9977	108	6	108	2	107	4	102	3
Carbaryl	500	5	0.9988	95	14	109	6	108	5	102	2
Naled	500	5	0.9968	98	4	112	8	110	3	101	5
Metalaxyl	15,000	5	0.9988	101	5	105	4	106	5	99	3
Spiroxamine*	<LOD	5	0.9977	104	6	106	2	105	2	101	3
Chlorantraniliprole	40,000	20	0.9971	-	-	93	7	104	6	104	5
Phosmet	200	5	0.9992	109	14	105	3	104	3	100	4
Azoxystrobin	40,000	5	0.9992	100	3	104	1	105	4	102	3
Fludioxonil	30,000	20	0.9949	-	-	109	13	97	6	101	6
Methiocarb*	<LOD	5	0.9988	116	16	105	5	107	5	101	4
Dimethomorph (I and II)	20,000	10	0.999	75	14	101	6	93	8	101	5
Boscalid	10,000	10	0.9964	108	15	102	12	102	2	103	3
Paclobutrazol*	<LOD	10	0.9979	99	9	106	1	108	3	100	4
Malathion	5000	10	0.9989	117	12	112	3	106	2	101	3
Myclobutanil	9000	10	0.9986	102	22	102	6	104	3	101	3
Bifenazate	5000	10	0.9994	118	20	110	3	104	10	102	5
Ochratoxin A	20	10	0.9957	99	8	99	24	104	8	-	-
Fenhexamid	10,000	10	0.9969	96	21	109	4	106	3	107	5
Spirotetramat	13,000	10	0.9987	83	18	107	6	106	3	105	3
Ethoprophos*	<LOD	5	0.9985	101	3	106	4	104	1	102	3
Fipronil*	<LOD	20	0.998	-	-	96	5	104	8	103	4
Fenoxycarb*	<LOD	10	0.9967	115	5	106	4	107	2	102	3
Kresoxym-methyl	1000	10	0.9993	112	20	104	10	102	4	103	3
Tebuconazole	2000	5	0.999	100	3	110	1	105	3	101	4
Spinosad- spinosyn A (71 %)a	3000¥	7.1	0.9988	117	2	110	3	108	2	102	1
Diazinon	200	5	0.9997	104	1	102	1	104	2	101	1
Coumaphos*	<LOD	10	0.9991	107	11	109	5	108	2	103	2
Pyridaben	3000	50	0.9994	-	-	93	12	113	6	103	1
Propiconazole	20,000	5	0.9991	96	6	108	4	104	5	103	3
Clofentezine	500	20	0.9978	-	-	102	5	105	3	106	4
Spinosad - spinosyn D (29%)b	3000¥	2.9	0.9993	106	8	101	2	103	5	104	4
Spinetoram - spinosyn J (80%)c	3000§	4	0.9995	104	7	102	3	108	4	102	2
Trifloxystrobin	30,000	5	0.9996	107	3	106	3	106	3	104	2
Prallethrin	400	10	0.9967	107	21	99	16	111	6	101	3
Pyrethrin II (34%)f	1000£	17	0.9977	-	-	94	11	112	4	106	6
Spinetoram - spinosyn L (20%)d	3000§	2	0.9993	107	10	109	4	107	3	102	1
Piperonyl Butoxide	8000	5	0.9998	110	5	99	2	94	3	95	5
Chlorpyrifos*	<LOD	20	0.9995	-	-	103	9	106	4	104	5
Hexythiazox	2000	10	0.9975	104	15	102	3	107	4	106	5
Etoxazole	1500	5	0.9995	103	4	104	2	103	1	100	1
Spiromesifen	12,000	5	0.9992	98	8	109	7	111	2	102	2
Pyrethrin I (54%)e	1000£	11	0.9977	-	-	98	5	105	12	104	5
Cyfluthrin	1000	50	0.999	-	-	93	11	102	23	115	10
Cypermethrin	1000	50	0.9961	-	-	115	11	98	18	104	6
(E)-Fenpyroximate	2000	5	0.9995	102	9	109	3	109	2	105	2
Permethrin-trans (59%)h	20,000¢	12	0.9994	-	-	99	8	104	5	101	3
Permethrin-cis (41%)g	20,000¢	8	0.9996	95	5	104	5	103	4	101	3
Avermectin B1a	300	50	0.9988	-	-	114	3	108	2	105	2
Etofenprox*	<LOD	5	0.9994	104	7	107	1	106	2	103	1
Bifenthrin	500	5	0.999	99	5	103	2	108	6	104	2
Acequinocyl	4000	10	0.9997	104	7	109	3	108	3	106	2
Quintozene (PCNB) (GC)	200	10	0.9966	110	14	102	5	101	1	97	3
Methyl parathion (GC)*	<LOD	5	0.9934	89	10	89	5	87	3	89	6
Captan (GC)	5000	10	0.9924	110	14	96	10	94	18	92	7
Chlordane (GC)*	<LOD	20	0.9913	-	-	105	9	93	8	85	10
Chlorfenapyr (GC)*	<LOD	10	0.9924	97	9	90	19	89	6	85	13
Cyfluthrin (GC)	1000	5	0.9935	107	10	92	18	91	7	89	11
Cypermethrin (GC)	1000	5	0.9938	95	9	83	17	97	15	93	9

*Category I pesticides, LOQ ≤100 ng/g
^aSpinosad- spinosyn A: Conc. 1: 7 ng/g; Conc. 2: 35.5 ng/g; Conc. 3: 71 ng/g; Conc. 4: 355 ng/g
^bSpinosad - spinosyn D: Conc. 1: 3 ng/g; conc. 2: 14.5 ng/g; Conc. 3: 29 ng/g; Conc. 4: 145 ng/g
^cSpinetoram - spinosyn J: Conc. 1: 8 ng/g; Conc. 2: 40 ng/g; Conc. 3: 80 ng/g; Conc. 4: 400 ng/g
^dSpinetoram - spinosyn L: Conc. 1: 2 ng/g; Conc. 2: 10 ng/g; Conc. 3: 20 ng/g; Conc. 4: 100 ng/g
^ePyrethrin I: Conc. 1: 5 ng/g; Conc. 2: 27 ng/g; Conc. 3: 54 ng/g; Conc. 4: 270 ng/g
^fPyrethrin II: Conc. 1: 3 ng/g; Conc. 2: 17 ng/g; Conc. 3: 34 ng/g; Conc. 4: 170 ng/g
^gPermethrin-cis: Conc. 1: 4 ng/g; Conc. 2: 20.5 ng/g; Conc. 3: 41 ng/g; Conc. 4: 205 ng/g
^hPermethrin-trans: Conc. 1: 6 ng/g; Conc. 2: 29.5 ng/g; Conc. 3: 59 ng/g; Conc. 4: 295 ng/g
^#Total of aflatoxin B1, B2, G1, and G2 should not exceed 20 ng/g.
^¥Total spinosad should not exceed 3000 ng/g.
^§Total spinetoram should not exceed 3000 ng/g.
^£ Total pyrethrins should not exceed 1000 ng/g.
^¢Total permethrins should not exceed 20,000 ng/g.

Tabella XI: Linearità per i cannabinoidi nelle caramelle gommose alla cannabis.

Cannabinoidi	Tempo di ritenzione	R2	Equazione
Cannabidiolic acid (CBDA)	2.142	0.9993	y = 2.08e+004x + 1.03e+003
Cannabigerol (CBG)	2.405	0.9981	y = 1.16e+004x + 1.85e+003
Cannabidiol (CBD)	2.535	0.9972	y = 1.17e+004x + 1.42e+003
Cannabinol (CBN)	3.776	0.9980	y = 2.70e+004x + 6.14e+004
Delta-9-tetrahydrocannabinol (Delta-9-THC)	4.753	0.9970	y = 1.06e+004x + 7.29e+003
Tetrahydrocannabinolic acid (THCA)	6.279	0.9986	y = 1.78e+004x - 1.28e+003

Tabella XII: Accuratezza e precisione per i cannabinoidi nelle caramelle alla cannabis.

Cannabinoide/Livello di fortificazione	Conc. estratto diluito (ppm)		Media (ppm)	SD	RSD (%)	Conc. estratto non diluito (ppm)	Conc. stimata del campione (mg/g)	Accuracy (%)	Errore percentuale
Caramelle fortificate a 0,2 mg/g	Replica 1	Replica 2
Cannabidiolic acid (CBDA)	4.2	4.4	4.3	0.1	3	43	0.2	107	7
Cannabigerol (CBG)	4.0	3.9	4.0	0.1	2	40	0.2	99	1
Cannabidiol (CBD)	4.1	4.2	4.1	0.1	2	41	0.2	103	3
Cannabinol (CBN)	4.0	4.1	4.1	0.1	3	41	0.2	101	1
Delta-9 tetrahydrocannabinol (Delta 9 THC)	4.0	4.2	4.1	0.1	3	41	0.2	103	3
Tetrahydrocannabinolic acid (THCA)	4.1	4.3	4.2	0.1	3	42	0.2	105	5
Gummy spiked at 0.5 mg/g
Cannabidiolic acid (CBDA)	10.4	10.7	10.6	0.2	2	106	0.5	106	6
Cannabigerol (CBG)	9.5	10.3	9.9	0.5	5	99	0.5	99	1
Cannabidiol (CBD)	9.8	10.6	10.2	0.5	5	102	0.5	102	2
Cannabinol (CBN)	9.8	10.3	10.0	0.4	4	100	0.5	100	0
Delta-9-tetrahydrocannabinol (Delta-9-THC)	9.9	10.3	10.1	0.3	3	101	0.5	101	1
Tetrahydrocannabinolic acid (THCA)	10.3	9.9	10.1	0.2	2	101	0.5	101	1

Conclusioni

È stato sviluppato un flusso di lavoro semplice ed efficace per l’analisi di pesticidi, micotossine e cannabinoidi nelle caramelle gommose alla cannabis. Le condizioni per la preparazione del campione includono l’omogenizzazione della matrice di pezzi di caramelle in acqua, l’estrazione degli analiti con acetonitrile acidificato seguita da una fase di salting-out con i sali di estrazione Q-sep QuEChERS, la diluizione dell’estratto (per i contaminanti e cannabinoidi analizzabili in LC-MS/MS) e infine la purificazione dSPE, per la quale si è utilizzato solfato di magnesio, PSA e GCB (per i pesticidi compatibili con GC-MS/MS). Per tutti i contaminanti target sono stati ottenuti risultati eccellenti in termini di LOQ, linearità, accuratezza e precisione. Inoltre, i dati hanno mostrato che la metodologia proposta è idonea per l’analisi di potenza, offrendo valori di accuratezza fra il 99% e il 107% per i sei cannabinoidi elencati dalle normative del governo californiano. In generale, il flusso di lavoro presentato snellisce il lavoro di laboratorio per l’analisi della cannabis in quanto permette una quantificazione eccellente di diverse classi di analiti in campioni di caramelle gommose utilizzando un solo estratto.

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