LC-MS/MS-Analytik von Mykotoxinen in Erdnusspulver in 5.5 Minuten

• Schnelle Analytik für höheren Probendurchsatz
• Ausgezeichnete Trennung verbessert die Genauigkeit für 12 kontrollierte Mykotoxine.
• Schnelle und einfache Probenvorbereitung (Verdünnen, Filtrieren, Analysieren)

Bestimmte Schimmelpilze, die auf landwirtschaftlichen Produkten wachsen können, produzieren toxische Metabolite, die als Mykotoxine bekannt sind. Selbst mit modernen Verfahren der Lebensmittelverarbeitung lassen sich diese Verbindungen nicht vollständig entfernen, so dass strikte Überwachungsprotokolle festgelegt wurden. Eine universelle Methode zur Analyse der Mykotoxine würde zwar ein hocheffizientes Screening ermöglichen, die Entwicklung einer derartigen Methode ist jedoch aufgrund der Unterschiede der physikochemischen Eigenschaften der Mykotoxine, der Extraktionseffizienzen und der Matrixeffekte eine große Herausforderung. Zhang et al. veröffentlichten eine Multi-Labor-Studie [1] mit dem Ziel, den Laboren ein analytisches Verfahren zur Verfügung zu stellen, das zur Analyse einer Vielzahl von Mykotoxinen in unterschiedlichsten Matrices geeignet ist. Aufbauend auf diesen Arbeiten entwickelten wir die folgende LC-MS/MS-Methode, mit der sich 12 FDA-kontrollierte Mykotoxine innerhalb des Druckbereiches herkömmlicher HPLC-Geräte trennen ließen.

Im vorliegenden Beispiel wurden Mykotoxine in einer Erdnusspulver-Matrix analysiert. Die Verwendung einer relativ kurzen Säule, die Selektivität der stationären Phase (Biphenyl) und die Effizienz der 2.7µm-Raptor Core-Shell-Partikel ermöglichten ausgezeichnete Trennungen in einer schnellen Analysenzeit von 5.5 Minuten (bei einer Gesamtzykluszeit von 7 Minuten). Eine koeluierende Matrixverbindung zeigte denselben stärksten MRM Übergang wie Mykotoxin HT-2 (447.3-285.3), so dass ein weniger empfindlicher Übergang (447.3-345.3) zur quantitativen Bestimmung ausgewählt wurde. Zur Erhöhung der Empfindlichkeit wurde ein Ammoniumpuffer verwendet, um eine bessere Ionisierung der Mykotoxine zu fördern. Die Raptor Biphenyl Säule eignete sich sehr gut für die 12 Mykotoxine, die in der zitierten Studie untersucht wurden. Für erweiterte Listen von Substanzen, die isobare Mykotoxine ähnlicher Strukturen enthalten, ist möglicherweise die Raptor FluoroPhenyl Phase erforderlich, um ausreichende chromatografische Auflösung zu erzielen. Die passende Selektivität der Raptor FluoroPhenyl-Säule wurde in einer Analyse von 20 Mykotoxinen unter Beweis gestellt.

Die vorliegende Methode zeigte ausgezeichnete Präzision und Richtigkeit für die 12 FDA-kontrollierten Mykotoxine, die im Rahmen einer Validierungsstudie mit einer Vielzahl von Matrices untersucht wurden (darunter verschiedene Quellen von Maismehl und braunem Reismehl neben dem hier gezeigten Erdnusspulver). Restek möchte sich bei Dr. Zhang für seine technische Unterstützung bei diesem Projekt bedanken.

	Peaks	tR (min)	Conc. (ng/g)	Precursor Ion	Product Ion 1	Product Ion 2
1.	Deoxynivalenol	0.62	50	297.3	249.3	231.2
2.	Fumonisin B1	2.45	50	722.5	352.4	334.5
3.	HT-2	2.60	50	447.3	345.3	285.3
4.	Fumonisin B3	2.85	50	706.5	336.4	318.4
5.	Fumonisin B2	3.23	50	706.5	336.3	141.2
6.	T2	3.31	50	489.3	245.2	387.4

	Peaks	tR (min)	Conc. (ng/g)	Precursor Ion	Product Ion 1	Product Ion 2
7.	Aflatoxin G2	3.74	5	331.2	313.3	189.3
8.	Zearalenone	3.96	50	319.3	283.3	187.2
9.	Aflatoxin G1	4.22	5	329.2	243.2	200.2
10.	Aflatoxin B2	4.43	5	315.3	287.3	259.2
11.	Aflatoxin B1	4.99	5	313.3	285.2	241.2
12.	Ochratoxin A	5.19	5	404.2	239.3	358.3

Matrix interference was observed for HT-2 transition 447.3-285.3 in peanut powder. Therefore, 447.3-345.3 was chose for quantification.

Column	Raptor Biphenyl (cat.# 9309A52)
Dimensions:	50 mm x 2.1 mm ID
Particle Size:	2.7 µm
Pore Size:	90 Å
Guard Column:	Raptor Biphenyl EXP guard column cartridge 5 mm, 2.1 mm ID, 2.7 µm (cat.# 9309A0252)
Temp.:	40 °C
Standard/Sample
Inj. Vol.:	5 µL
Mobile Phase
A:	Water, 2 mM ammonium formate, 0.1% formic acid
B:	Methanol, 2 mM ammonium formate, 0.1% formic acid
	Time (min) Flow (mL/min) %A %B %C 0.00 0.5 70 30 0.6 0.5 70 30 0.7 0.5 50 50 3.0 0.5 25 70 4.5 0.5 25 75 5.0 0.5 10 90 5.2 0.5 10 90 5.21 0.5 25 75 6.00 0.5 25 75 6.01 0.5 70 30 7.00 0.5 70 30

Detector	MS/MS
Ion Mode:	ESI+
Mode:	MRM
Instrument	UHPLC
Sample Preparation	Weighed 1.00 gram of peanut powder in a 50 mL centrifuge tube and added 2.00 mL of water. Vortexed at 3000 rpm for 5 min followed by the addition of 4.0 mL of extraction solvent (50:50 water:acetonitrile, v/v). The tube was then vortexed at 3000 rpm for 5 min followed by centrifugation for 15 min at 4200 rpm. 475 μL of the supernatant was filtered through a Thomson SINGLE StEP Nano filter vial (0.2 μm, cat.# 25882). The sample was then fortified with 25 μL of a standard solution prepared in water at 1000 ng/mL (100 ng/mL for aflatoxins and ochratoxin A) as part of the matrix-matched calibration curve. Vortexed at 3000 rpm for 1 min prior to analysis.
Notes	Want even better performance when analyzing metal-sensitive compounds? Check out Inert LC columns at www.restek.com/inert.

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Literatur

1. K. Zhang, M.R. Schaab, G. Southwood, E.R. Tor, L.S. Aston, W. Song, B. Eitzer, S. Majumdar, T. Lapainis, H. Mai, K. Tran, A. El-Demerdash, V. Vega, Y. Cai, J.W. Wong, A.J. Krynitsky, T.H. Begley, A collaborative study: determination of mycotoxins in corn, peanut butter, and wheat flour using stable isotope dilution assay (SIDA) and liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), Journal of Agricultural and Food Chemistry, 65 (33) (2017) 7138-7152. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27983809.