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Migliora l’analisi dell’acrilammide negli alimenti con colonne LC di lunga durata e standard interni convenienti

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L’acrilammide può formarsi nei prodotti alimentari dalla reazione tra gli zuccheri e l’amminoacido asparagina durante le preparazioni ad alta temperatura, come la frittura e la cottura alla griglia, arrosto o al forno. Alimenti come le patatine, i prodotti da forno a base di cereali e il caffè sono esempi di prodotti che sono stati cruciali per determinare la presenza e la concentrazione dell’acrilammide. La rilevazione dell’acrilammide negli alimenti è stata documentata per la prima volta nel 2002 dall’ente nazionale svedese per gli alimenti, e da allora si sono profusi sforzi sempre maggiori sul piano internazionale per comprenderne meglio l’origine nei prodotti alimentari per il consumo umano e animale, il livello di contaminazione nei vari alimenti e i potenziali effetti sulla salute legati all’esposizione alimentare. L’acrilammide è classificata come sostanza chimica estremamente pericolosa ed è stato dimostrato che in grandi quantità può essere cancerogena negli animali da laboratorio (sebbene a oggi non sia stato dimostrato alcun collegamento diretto fra l’esposizione alimentare e una maggiore incidenza del cancro sull’uomo). Al fine di tutelare la salute pubblica, gli scienziati hanno bisogno di metodi più efficienti per determinare in modo accurato la concentrazione di acrilammide in alimenti e bevande. Qui mettiamo a confronto i tipici metodi di analisi dell'acrilammide in prodotti alimentari e un processo migliorato che utilizza una colonna Allure Acrilammide e uno standard interno deuterato. Tra i vantaggi vi sono tempi di analisi più rapidi e un aumento della produzione di campioni senza che venga meno l’idoneità del sistema.

Approccio analitico attuale

La LC-MS/MS è la tecnica che va per la maggiore

L’analisi accurata dell’acrilammide nelle matrici alimentari ha presentato alcune sfide tecniche. Inizialmente, per le separazioni GC sono state utilizzate tecniche di rilevazione in spettrometria di massa perché l’acrilammide è un composto piccolo e relativamente volatile. Queste tecniche si basavano però sulla conversione dell’acrilammide in un derivato bromurato, un passaggio che sarebbe meglio evitare [1]. In seguito sono state vagliate le tecniche LC-MS/MS, che ora rappresentano lo strumento analitico più comune nelle analisi di routine dell’acrilammide nei campioni alimentari. Ma i metodi LC-MS/MS affrontano ancora delle difficoltà analitiche, in particolare nella ritenzione selettiva dell’acrilammide e nella sua separazione dai composti co-estratti dalle matrici complesse che vengono tipicamente analizzate.

Utilizzare colonne LC con carbonio grafitato poroso (PGC)

L’Europa ha formalizzato il metodo EN 16618:2015 per l’analisi dell’acrilammide negli alimenti, che prevede l’utilizzo di precolonne e colonne analitiche LC contenenti carbonio grafitato poroso (PGC); uno dei motivi è il fatto che i meccanismi tradizionali di ritenzione a fase inversa (RP) presentano delle difficoltà nell’analisi dell’acrilammide. Ora le colonne PGC sono comunemente utilizzate nel settore perché riescono a trattenere l’acrilammide a sufficienza per separarla dai componenti della matrice che possono essere stati co-estratti, anche dopo la procedura di preparazione del campione piuttosto rigorosa delineata dal metodo EN. La colonna PGC è in grado di operare anche in fasi mobili al 100% acquose, una condizione in cui molte colonne RP andrebbero incontro al fenomeno detto “dewetting”, che comporterebbe una perdita del tempo di ritenzione e la necessità di rigenerare la colonna con un lungo risciacquo con una fase mobile al 100% organica.

Utilizzare standard interni deuterati

Nonostante una quantificazione accurata sia importantissima, il processo di estrazione può dare luogo a una variazione considerevole; proprio per questo motivo, il metodo EN raccomanda di aggiungere al campione degli standard interni insieme al solvente di estrazione. Il metodo EN prevede di utilizzare standard interni deuterati anziché quelli marcati sul carbonio, anch’essi comunemente utilizzati per l’analisi dell’acrilammide. Molto meno costosa rispetto all’acrilammide marcata sul carbonio, l’acrilammide-d3 è un’alternativa eccellente ed economicamente vantaggiosa quando si tratta di scegliere gli standard interni.

Requisiti del metodo

Il tempo necessario per l’analisi dell’acrilammide negli alimenti con il metodo EN 16618:2015 è di 8 minuti. Per soddisfare i requisiti di idoneità del sistema, l’acrilammide non deve eluire prima di 1,7 minuti, ma il tempo successivo all’eluizione è necessario per il risciacquo dalla colonna dei componenti della matrice, rimasti nell’estratto del campione anche dopo il processo SPE di preparazione del campione in due fasi previsto dal metodo EN. Le colonne PGC mostrano una forte ritenzione dei componenti della matrice, e se questi non vengono drenati a sufficienza fra un’analisi e l’altra possono pregiudicare la prestazione al punto di non consentire la ritenzione in 1,7 minuti come richiesto dal sistema.

Ritornare a una ritenzione a fase inversa può aumentare la produzione di campioni

Utilizzando le colonne PGC, i laboratori si avvicinano al limite di idoneità del sistema e si trovano di fronte a una scelta: proseguire con la lunga procedura di rigenerazione della colonna, sperando di recuperare i requisiti di idoneità, oppure sostituire la precolonna in uso e probabilmente anche la colonna analitica. Entrambe le opzioni richiedono tempo e denaro e interrompono la produzione di campioni. Passare a una colonna Allure Acrilammide è un’alternativa migliore: la chimica a fase inversa brevettata incorpora un unico ligando polare che è in grado di trattenere l’acrilammide, è compatibile con condizioni al 100% acquose e, rispetto alle colonne PGC, offre tempi di corsa inferiori e una maggiore durata della colonna. Utilizzare una precolonna e una colonna analitica Allure Acrilammide offre un equilibrio imbattibile in quanto consente di trattenere l’acrilammide abbastanza a lungo da soddisfare i requisiti di idoneità del sistema EN, ma allo stesso tempo non trattiene i composti della matrice co-estratti al punto da non riuscire a risciacquarli rapidamente dalla colonna tra un’analisi e l’altra. I laboratori che adottano le colonne Allure Acrilammide possono quindi analizzare un maggior numero di campioni utilizzando meno colonne: un fattore di risparmio non da poco per qualsiasi laboratorio di sicurezza alimentare. Gli esempi riportati di seguito mostrano i vantaggi che i laboratori di sicurezza alimentare a elevata produttività possono trarre dall’uso di una precolonna e una colonna Allure Acrilammide insieme a standard interni deuterati.

Tempi di analisi più brevi

Poiché i composti della matrice eluiscono velocemente dalla colonna Allure Acrilammide, questa è in grado di equilibrarsi ed essere pronta per l’iniezione successiva più in fretta perfino rispetto a una colonna PGC in condizioni ottimali. La figura 1 illustra un esempio di due metodi diversi per l’analisi dell’acrilammide nei prodotti alimentari (in questo caso nelle patatine): un metodo utilizza la colonna Allure Acrilammide e l'altro una colonna PGC esemplificativa. Il metodo con la colonna PGC è stato ulteriormente ottimizzato rispetto al metodo EN, riducendo il tempo di analisi da 8 a 7 minuti, pur mantenendo il risciacquo ottimale della colonna e il tempo di equilibratura. Nessun tipo di risciacquo ulteriore ha mostrato vantaggi significativi sulla durata della colonna. L’analisi dell’acrilammide sulla colonna Allure Acrilammide ha soddisfatto il requisito di metodo della ritenzione in 1,7 minuti con una buona separazione dai componenti della matrice, ma con tempi di equilibratura molto più brevi. Con un risparmio per ogni analisi di 2,5 minuti rispetto al metodo EN 16618:2015 e di 1,5 minuti rispetto al metodo ottimizzato con colonna PGC, Allure Acrilammide consente di analizzare un maggior numero di campioni a ogni turno, aumentando la produzione del laboratorio.

Figura 1: Adottando la colonna Allure Acrilammide, i laboratori possono aumentare la produzione di campioni in quanto è richiesto un tempo di equilibratura più breve rispetto a una colonna PGC, anche su una matrice complessa come le patatine.

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LC_FS0532
PeaksConc.
(ng/mL)
PrecursorProduct
1.Acrylamide-d3 (IS)20075.158.1
2.AcrylamideEndogenous72.155.1
ColumnSee notes
Temp.:22 °C
Standard/SampleAcrylamide-d3
Diluent:Water
Inj. Vol.:10 µL
Mobile PhaseA. 0.001% Formic acid in water, B. 0.001% formic acid in acetonitrile
Flow:0.4 mL/min
DetectorMS/MS
Ion Mode:ESI+
Mode:MRM
InstrumentHPLC
Sample PreparationExtracted per EN 16618:2015

Weighed 2.0 g of homogenized potato chips into a 50 mL centrifuge tube. Added 40 mL water followed by the addition of internal standard. Shook by hand for 30 sec, by vortexer for 15 sec, and then on a mechanical shaker for 60 min set to maximum sample extraction agitation. Centrifuged in a refrigerated centrifuge at 10 °C, 3600 x g for 20 min. Removed the aqueous layer after centrifugation, taking care to avoid the top, fatty layer, or the solids at the bottom of the tube. Placed the aqueous extract in an appropriate container.

For cleanup, the first SPE cartridge (multimode SPE column with nonpolar, SAX, and SCX properties, 1000 mg/6 mL) was conditioned with 3 mL methanol and x2, 6 mL aliquots of water. Passed 10 mL of the aqueous extract through the column and collected eluate. For the next cleanup step, the second SPE cartridge (crosslinked polystyrene/poly-DVB SPE column, 500 mg/6 mL) was conditioned with 5 mL methanol and 5 mL water. Passed the eluate from the previous step entirely through the column. Rinsed the loaded cartridge once with 4 mL water and discarded the rinsing solvent. Eluted the acrylamide with 2 mL of 60% methanol in water. Collected the sample and transferred into an evaporation tube. Placed the tube in an evaporator at a temperature no higher than 40 °C to remove the methanol. Evaporated until the final volume was 0.5–0.8 mL using a gentle flow of nitrogen. Transferred the final sample into an autosampler vial and analyzed by LC-MS/MS.
NotesColumn Details
A. Allure Acrylamide column: 5 μm, 50 mm x 2.1 mm ID analytical column (cat.# 9167552) with 5 μm, 10 mm x 2.1 mm ID guard cartridge (cat.# 916750212).
B. Porous graphitized carbon column: 5 μm, 50 mm x 2.1 mm ID analytical column with 5 μm, 10 mm x 2.1 mm ID guard cartridge.

Mobile Phase Gradients (%B)
A. Allure Acrylamide column: 0.00 min (0%), 1.00 min (0%), 2.00 min (90%), 2.01 min (0%), 5.50 min (0%), flow = 0.4 mL/min.
B. Porous graphitized carbon column: 0.00 min (0%), 1.70 min (0%), 2.70 min (90%), 2.71 min (0%), 7.00 min (0%), flow = 0.4 mL/min.

Maggiore durata delle colonne

La figura 2 illustra l’ottima stabilità dei tempi di ritenzione dell’acrilammide ottenuti con la colonna Allure Acrilammide rispetto a una colonna PGC esemplificativa, che invece mostra una perdita di ritenzione quasi immediata e infine, dopo 475 iniezioni di un campione di caffè, estratto e purificato seguendo il metodo EN 16618:2015, non riesce più a rispettare il requisito del tempo di ritenzione di 1,7 minuti. Anche dopo 1000 iniezioni, invece, le prestazioni di Allure Acrilammide sono rimaste stabili e pronta per l’iniezione successiva. La figura 3 mostra che la cromatografia sulla colonna Allure Acrilammide è rimasta invariata dalla prima alla millesima iniezione. La sua capacità di eluire - e non trattenere fortemente - i composti della matrice co-estratti è la chiave per ottenere prestazioni estremamente stabili su centinaia e centinaia di ripetizioni di iniezioni di matrice, richiedendo poca se non nessuna manutenzione.

Figura 2: La colonna Allure Acrilammide soddisfa i requisiti di idoneità del sistema EN 16618:2015 anche dopo 1000 iniezioni, oltre il doppio delle iniezioni consentite da una tipica colonna PGC.

decorative

Figura 3: Anche dopo 1000 iniezioni di estratto di caffè, la prestazione della colonna Allure Acrilammide è rimasta invariata, senza richiedere alcuna manutenzione del sistema nè la sostituzione della precolonna. 

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LC_FS0533
PeaksConc.
(ng/mL)
PrecursorProduct
1.Acrylamide-d3 (IS)20075.158.1
2.AcrylamideEndogenous72.155.1
ColumnAllure Acrylamide (cat.# 9167552)
Dimensions:50 mm x 2.1 mm ID
Particle Size:5 µm
Pore Size:60 Å
Guard Column:Allure Acrylamide 10 mm, 2.1 mm ID, 5 µm (cat.# 916750212)
Temp.:22 °C
Standard/Sample
Diluent:Water
Inj. Vol.:10 µL
Mobile Phase
A:0.001% Formic acid in water
B:0.001% Formic acid in acetonitrile
Time (min)Flow (mL/min)%A%B
0.000.41000
1.000.41000
2.000.41090
2.010.41000
5.500.41000
DetectorMS/MS
Ion Mode:ESI+
Mode:MRM
InstrumentHPLC
Sample PreparationExtracted per EN 16618:2015

Weighed 2.0 g of ground coffee into a 50 mL centrifuge tube. Added 5 mL n-hexane and 40 mL water followed by the addition of internal standard. Shook by hand for 30 sec, by vortexer for 15 sec, and then on a mechanical shaker for 60 min set to maximum sample extraction agitation. Centrifuged in a refrigerated centrifuge at 10 °C, 3600 x g for 20 min. Removed the aqueous layer after centrifugation, taking care to avoid the top, hexane layer, or the solids at the bottom of the tube. Placed the aqueous extract in an appropriate container.

For cleanup, the first SPE cartridge (multimode SPE column with nonpolar, SAX and SCX properties, 1000 mg/6 mL) was conditioned with 3 mL methanol and x2, 6 mL aliquots of water. Passed 10 mL of the aqueous extract through the column and collected eluate. For the next cleanup step, the second SPE cartridge (crosslinked polystyrene/poly-DVB SPE column, 500 mg/6 mL) was conditioned with 5 mL methanol and 5 mL water. Passed the eluate from the previous step entirely through the column. Rinsed the loaded cartridge once with 4 mL water and discarded the rinsing solvent. Eluted the acrylamide with 2 mL of 60% methanol in water. Collected the sample and transferred into an evaporation tube. Placed the tube in an evaporator at a temperature no higher than 40 °C to remove the methanol. Evaporated until the final volume was 0.5–0.8 mL using a gentle flow of nitrogen. Transferred the final sample into an autosampler vial and analyzed by LC-MS/MS.

Prestazioni stabili tra una colonna e l’altra

Sviluppate per operare anche in fasi mobili al 100% acquose, le precolonne e le colonne analitiche Allure Acrilammide di Restek offrono le stesse solide prestazioni iniezione dopo iniezione, e colonna dopo colonna. Le nostre rigorose procedure di fabbricazione e i severi test di qualità garantiscono che, quando arriverà il momento di sostituire la colonna Allure Acrilammide, la nuova colonna offrirà la stessa prestazione di analisi dell’acrilammide su cui potevi contare con la precedente (figura 4).

Figura 4: Le robuste colonne LC Allure Acrilammide a fase inversa offrono risultati riproducibili colonna dopo colonna, lotto dopo lotto.

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LC_FS0534
PeaksConc.
(ng/mL)
PrecursorProduct
1.Acrylamide-d3 (IS)20075.158.1
2.Acrylamide20072.155.1
ColumnAllure Acrylamide (cat.# 9167552)
Dimensions:50 mm x 2.1 mm ID
Particle Size:5 µm
Pore Size:60 Å
Guard Column:Allure Acrylamide 10 mm, 2.1 mm ID, 5 µm (cat.# 916750212)
Temp.:22 °C
Standard/SampleAcrylamide (cat.# 30494)
Diluent:Water
Inj. Vol.:10 µL
Mobile Phase
A:0.001% Formic acid in water
B:0.001% Formic acid in acetonitrile
Time (min)Flow (mL/min)%A%B
0.000.41000
1.000.41000
2.000.41090
2.010.41000
5.500.41000
DetectorMS/MS
Ion Mode:ESI+
Mode:MRM
InstrumentHPLC

Una soluzione migliore per l’analisi dell’acrilammide negli alimenti

Le colonne PGC utilizzate nel metodo EN 16618:2015 trattengono sufficientemente l’acrilammide, ma la loro forte ritenzione dei componenti della matrice co-estratti richiede tempi di equilibratura lunghi e riduce la durata della colonna. È possibile ottenere un’analisi dell’acrilammide più veloce utilizzando le colonne Allure Acrilammide, che offrono una sufficiente ritenzione dell’acrilammide e allo stesso tempo consentono di risciacquare i composti della matrice in maniera più efficace ed efficiente. I requisiti di idoneità del sistema riescono quindi a essere mantenuti su più iniezioni, consentendo di analizzare un maggior numero di campioni prima che sia necessaria una manutenzione. Abbinare le colonne analitiche e le cartucce per precolonne Allure agli standard interni deuterati permette ai laboratori di aumentare produttività e redditività, consentendo di analizzare più campioni in meno tempo e con un minor numero di colonne.

Bibliografia

  1. J.A.G. Roach, D. Andrzejewski, M.L. Gay, D. Nortrup, S.M. Musser, Rugged LC-MS/MS survey analysis for acrylamide in foods, J. Agric. Food Chem. 51 (2003) 7547−7554. https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jf0346354
FFAR3126B-IT