Optimierung der GC-MS- und GC-MS/MS-Analyse von 3-MCPD und Glycidylestern in Speiseölen

Zusammenfassung

3-MCPD und Glycidylester in Speiseölen sind Verunreinigungen, die bei der Raffination entstehen und als potenzielle Humankarzinogene eingestuft werden. Methoden zu ihrer Analyse wurden von ISO, AOCS und DGF entwickelt. Während diese Methoden die Verfahren zur Extraktion und Derivatisierung eingehend behandeln, wird der GC-MS-Analysemethode nur geringe Aufmerksamkeit geschenkt. Bei den neuen automatisierten Systemen, die den Arbeitsablauf der Probenvorbereitung rationalisieren, ist es wichtig, die Analyse durch Optimierung der Methodenbedingungen und Injektionstechniken zu vereinfachen und zu beschleunigen.

Unsere anfängliche Optimierung des Temperaturprogramms für den GC-Ofen führte zu einer Verringerung der Analysezeit um 8 Minuten. Zusätzliche Zeiteinsparungen lassen sich mithilfe der kostenlosen Methodenentwicklungs-Software (Pro EZGC Chromatogram Modeler) erzielen. Aktuelle veröffentlichte Methoden empfehlen entweder die Verwendung eines Split/Splitlos- oder eines PTV-Injektors, die beide im Splitlos-Modus arbeiten. Wir haben die Split-Injektion untersucht und beobachteten verbesserte Peakformen, was nicht unerwartet war. Allerdings ließen sich mit der Split-Injektionstechnik auch ähnliche Nachweisgrenzen wie bei der splitlosen Injektion erzielen, im Gegensatz zu den typischen Erwartungen für diese beiden Techniken.

Einführung

3-Monochlorpropandiol (3-MCPD)-Ester sind Kontaminanten diverser raffinierter Öle. Sie entstehen aus natürlich vorkommenden Acylglyceriden in Gegenwart von chlorierten Verbindungen bei hohen Temperaturen während der Desodorierung [1]. Ihre Konzentration in raffinierten Ölen variiert, wobei der höchste Anteil in Palm- und Walnussölen zu finden ist. Tierstudien zeigen, dass die 3-MCPD-Ester im Gastrointestinaltrakt unter Freisetzung des toxischen 3-MCPD hydrolysiert werden. In Ratten und Mäusen sind die Nieren und die männlichen Fortpflanzungsorgane die bevorzugten Ziele dieser Toxizität. [2].

Glycidylester kommen ebenfalls als Kontaminanten in raffinierten Ölen vor, werden aber auf andere Weise erzeugt als 3-MCPD-Ester [3]. Glycidylester bilden sich bei hohen Temperaturen (>240 °C) aus Diacylglyceriden, und die Gegenwart von chlorierten Verbindungen ist für diese Reaktion nicht erforderlich. Ihr Abbauverhalten nach dem Verzehr ähnelt dem der 3-MCPD-Ester, d.h. sie werden im Gastrointestinaltrakt zu Glycidol hydrolysiert. Glycidol erwies sich in Tierversuchen als genotoxisch und karzinogen. Die chemischen Strukturen dieser Verbindungen sind in Abbildung 1 dargestellt.

Mit der Abkehr der Lebensmittelindustrie von partiell hydrierten Ölen stehen trans-Fettsäuren weniger im Mittelpunkt. Zunehmendes Interesse richtet sich zur Zeit eher auf die Nebenprodukte der Ölraffination. 3-MCPD und Glycidylester (GE) sind mutmaßliche Karzinogene und obwohl es keine Grenzwerte der U.S. Food and Drug Administration (FDA) gibt, hat die Europäische Behörde für Lebensmittelsicherheit (EFSA, European Food Safety Authority) eine tolerierbare Tagesdosis von 2 µg/kg Körpergewicht für 3-MCPD festgelegt [4]. Die Europäische Union (EU) erwägt Höchstgrenzen für 3-MCPD-Ester von 1.25 mg/kg für ausgewählte unraffinierte und raffinierte Öle wie Olivenöl (ohne Tresteröl), Sonnenblumen-, Soja- und Palmkernöl, und von 2.5 mg/kg für andere raffinierte Pflanzenöle sowie Meeres- und Fischöle [5].

Die Analyse der Isomere von MCPD-Estern und Glycidylestern kann auf zweierlei Weise erfolgen: direkt und indirekt. Die direkte Methode verwendet normalerweise ein LC-MS-System, das ohne vorherige chemische Umwandlung der MCPD- oder Glycidylester umfassende Informationen über die Probenzusammensetzung liefert. Ohne Umesterung sollte weder die Umwandlung von MCPD-Estern in Glycidylester noch die umgekehrte Reaktion stattfinden, obwohl der hohe Hintergrund von Triacylglyceriden entfernt werden muss, um zu verhindern, dass diese Störsubstanzen zu einer Unterschätzung der Zielanalyten führen. Bei diesem Schritt ist darauf zu achten, dass das Verfahren zur Probenreinigung nicht auch MCPD- und Glycidylester entfernt. Darüber hinaus sind für eine genaue Quantifizierung Standards für die einzelnen Ester erforderlich, und ihre Bestimmung erfordert hochempfindliche Instrumente wie z. B. ein hochauflösendes Massenspektrometer.

Die zweite Methode umfasst eine indirekte Analyse. Diese Methode wird für Routineanalysen bevorzugt, da sie deutlich weniger Standards erfordert, und die Probenvorbereitung kann automatisiert werden. Dazu gehören die drei AOCS-Methoden (Cd 29a-13, Cd 29b-13 und Cd 29c-13) für die Analyse von MCPD- und Glycidylestern in Speiseölen. Den drei Methoden liegt ein ähnliches Reaktionsschema zugrunde: eine Umesterung zur Umwandlung der Triacylglyceride in Fettsäuremethylester (FAMEs); eine Neutralisation der alkalischen Bedingungen, die aus der Umesterung resultieren; und eine Extraktion der FAMEs als Reinigungsschritt. Im Anschluss an die Extraktion des freien MCPD und des Glycidols [umgewandelt entweder zu MCPD oder zu bromiertem Propandiol (MBPD), abhängig von der spezifischen Methode] erfolgt die Derivatisierung mit Phenylboronsäure (PBA), um die Flüchtigkeit des Analyten zu verbessern und die GC-Trennung und die MS- oder MS/MS-Analyse zu erleichtern. Während diese Methoden die Probenhandhabung eingehend behandeln, wird der GC-MS-Analysemethode nur geringe Aufmerksamkeit geschenkt. Neue automatisierte Systeme können die Probenvorbereitung rationalisieren und die Analysemethode lässt sich ebenfalls optimieren, um die Gesamtleistung zu verbessern.

Die AOCS-Methoden bieten zum Beispiel eine Möglichkeit zur Optimierung des Ofentemperaturprogramms, um dadurch die Analyse zu beschleunigen, und auch wenn dies letztlich nicht zu einer Steigerung des Probendurchsatzes führt, weil automatisierte Probenvorbereitungsschritte mehr Zeit in Anspruch nehmen können als die Analyse selbst, so besteht immerhin die Möglichkeit, die Säule zwischen den Analysen gründlicher zu konditionieren oder kostensparende Maßnahmen wie die Verringerung des Gasflusses zwischen den Analysen durchzuführen.

Neben dem Ofentemperaturprogramm wurde auch die Injektionstechnik untersucht, um herauszufinden, ob sich mit Split-Injektionen akzeptable Ergebnisse erzielen lassen. Normalerweise erfordern die Methoden die Verwendung von Splitlos-Injektionen durch einen Split/Splitlos-Injektor oder einen temperaturprogrammierten Injektor wie z. B. den PTV-Injektor. Durch Verwendung einer Split-Injektion, insbesondere bei Probenvorbereitungsmethoden, die eine Derivatisierung des Analyten erfordern, können Sie jedoch die Menge des Derivatisierungsreagenzes, die auf die Säule überführt wird, drastisch reduzieren und so möglicherweise die Lebensdauer der Säule verlängern.

Wir haben die Verwendung von zwei verschiedenen Injektoren (PTV und Split/Splitlos) und zwei Injektionstechniken (Split und Splitlos) bei verschiedenen Temperaturen ausgewertet. Die Bewertung der Methodenleistung basierte auf den instrumentellen Nachweisgrenzen (LOD) und der Methodenempfindlichkeit, die durch die Steigung der Kalibrierkurve gemessen wurde.

Experimenteller Teil

Chemikalien und Materialien

LC-MS-taugliche Lösemittel wurden von Fisher Scientific bezogen. Diethylether, freies 3-MCPD, Natriummethoxid (25% in Methanol), Natriumhydroxid, Natriumchlorid, Natriumbromid, Schwefelsäure (25 %), Orthophosphorsäure (85%) und Phenylboronsäure wurden von Sigma Aldrich gekauft. Freies 2-MCPD, 2-MCPD-d5 sowie Glycidyl-d5-stearat wurden von Toronto Research Chemicals gekauft. Lösungen von 3-MCPD-Dipalmitat, 3-MCPD-d5-Dipalmitat und Glycidylstearat waren maßgefertigte Standards der Restek Corporation. Standards wurden bei -20 °C aufbewahrt. Als Leerwertmatrix wurde natives Olivenöl extra (EVOO), erworben von einem lokalen Lebensmittelgeschäft, verwendet und im Dunkeln bei Raumtemperatur aufbewahrt.

Probenvorbereitung

Maßgefertigte Restek-Standards wurden als Arbeitslösungen verwendet, zusammen mit aus reinen Materialien hergestellten Lösungen. Kalibrierstandards (3-MCPD-Ester oder Glycidylester) wurden für einen Bereich von 0.002–12 mg/kg in Öl hergestellt.

Angereicherte EVOO-Proben wurden anschließend für die Analyse vorbereitet, indem modifizierte Versionen der AOCS-Methoden Cd 29b-13 und Cd 29c-13 verwendet wurden (das Schema der Methode Cd 29c-13 ist in Abbildung 2 dargestellt). Änderungen der veröffentlichten Methoden dienten in erster Linie dazu, die Menge des verwendeten Lösemittels zu reduzieren. Die Ölproben in beiden Protokollen wurden in Methyl-tert-butylether (als Ersatz für Diethylether in Methode Cd 29b-13) gelöst. Im zweiten Extraktionsschritt (Abbildung 2) wurde die Menge an Diethylether/Ethylenacetat auf 500 µL pro Extraktion reduziert (insgesamt 1.5 mL). Proben, die für qualitative Zwecke verwendet wurden, wurden im Lösemittel Diethylether/Ethylenacetat belassen. Weitere Einzelheiten zur Methode entnehmen Sie bitte der entsprechenden AOCS-Methode.

Pro EZGC Model

Resteks Online-Version der Pro EZGC Chromatogramm-Modelliersoftware (www.restek.com/proezgc) ist ein Selektivitäts-Tool, das sich auf eine vorinstallierte Bibliothek von thermodynamischen Retentionsindizes stützt. Die thermodynamischen Retentionsindizes wurden für Rxi-17Sil MS-Säulen generiert. Dazu wurden die folgenden Verbindungen verwendet: freies 3-MCPD, 3-MCPD-d5, 2-MCPD, 2-MCPD-d5, Glycidylester und Glycidyl-d5-ester. Die freien 3-MCPD, 3-MCPD-d5, 2-MCPD und 2-MCPD-d5 wurden in Ethylacetat gelöst und vor der Analyse mit PBA derivatisiert. Die Glycidylester und Glycidyl-d5-ester wurden in freies 3-MBPD bzw. 3-MBPD-d5 umgewandelt und entsprechend der angepassten AOCS-Methode Cd 29b-13 mit PBA derivatisiert. Proben für Pro EZGC Model wurden in Konzentrationen von 50-100 µg/mL hergestellt.

Instrumentierung

Ein Agilent 7890A GC, gekoppelt mit einem 5975C MSD, wurde für die Versuche zur Methodenoptimierung und für Analysen höherer Konzentrationen verwendet. Für Analysen im Spurenbereich wurde ein Thermo Fisher Scientific Trace 1310 GC, gekoppelt mit einem TSQ 8000 MS/MS, verwendet. Die Daten wurden mit der Agilent MSD Chemstation-Software (Version F.01.03) und der Thermo Scientific TraceFinder-Software (Version 4.1 EFS) verarbeitet. Die Tests wurden mit zwei Rxi-17Sil MS-Säulen mit Abmessungen von 30 m x 0.25 mm x 0.25 µm (Art.-Nr. 14123) und 20 m x 0.18 mm x 0.18 µm (Art.-Nr. 14102) durchgeführt. Die 20 m-Säule wurde im Agilent-Gerät und die 30 m-Säule in beiden Geräten verwendet. Für das Agilent-Gerät (Art.-Nr. 23316) wurde ein Topaz 2.0 mm ID mit Einfachkonus und Glaswolle-Liner verwendet, für das Thermo-Gerät (Art.-Nr. 23438) ein Topas 2.0 mm ID-Baffled-Liner für PTV. Bei beiden Geräten wurde Helium im Modus Konstanter Fluss verwendet. Die Temperaturprogramme für die Injektoren und Säulenöfen sind in Tabelle I dargestellt. Die Anfangseinstellungen wurden den AOCS-Methoden Cd 29b-13 und Cd 29c-13 entnommen. Die Anfangstemperatur für beide PTV- und GC-Programme wurde zwischen 85 °C und 120 °C variiert, um die endgültigen Programme zu bestimmen.

Tabelle I: Temperaturprogramme für Injektoren und Säulenöfen.

Die Quantifizierung wurde mithilfe der Kalibriermethode mit deuterierten internen Standards unter Verwendung der Fläche der im SIM-Modus für Single Quad oder im SRM-Modus für Triple Quad erfassten Zielionen durchgeführt. Die gemessenen Ionen sind in Tabelle II angegeben. Zur Berechnung der instrumentellen Nachweisgrenzen (LODs) wurde eine Kalibrierkurve nach der Methode der kleinsten Fehlerquadrate mit der Formel LOD = 3.3*s y/k verwendet, wobei k die Steigung der Kalibrierkurve und s y der Standardfehler des vorhergesagten y-Wertes für jeden x-Wert ist; s y wurde durch lineare Regression nach der Methode der kleinsten Quadrate erhalten.

Tabelle II: GC-MS SIM-Ionen und GC-MS/MS SRM-Übergänge für alle Analyten.

Ergebnisse und Diskussion

In Fällen, in denen die Analysezeit des Geräts die Zeit der Probenvorbereitung übersteigt, kann eine Verkürzung dieser Analysezeit einen höheren Probendurchsatz ermöglichen. Selbst wenn der Probenvorbereitungsschritt mehr Zeit erfordert als die Geräteanalyse, ist es immer noch vorteilhaft, nach Möglichkeiten zur Verkürzung der Laufzeit zu suchen. Die kürzere Analyse ermöglicht eine längere Säulenkonditionierung zwischen den Läufen und die Möglichkeit eines geringeren Trägergasverbrauchs durch die Verwendung von Gassparfunktionen oder Methodenänderungen, die den Gasfluss zwischen den Analysen reduzieren.

Die AOCS-Methoden Cd 29b-13 und Cd 29c-13 nutzen das gleiche GC-Temperaturprogramm und verwenden PTV im Splitlos-Modus. Die Anfangstemperatur beträgt 85 °C für GC und PTV. Da jedoch keine Lösemittelkondensation erforderlich ist, wenn der erste Analyt bei der relativ langsamen Rampenrate des Ofens nach 13 Minuten eluiert, wurde eine höhere Injektor- und Ofentemperatur untersucht, um festzustellen, ob die Analysezeit durch kürzere Injektor- und Ofentemperaturprogramme ohne Beeinträchtigung der Performance verkürzt werden kann. Basierend auf der Berechnung des Lösemitteldampfs für Isooktan und einem 2 mm-Liner beträgt die maximale Splitlos-Temperatur 120 °C. Die getestete Probe wurde durch Anreicherung von 3-MCPD-Dipalmitat in einer Konzentration von 5 mg/kg in EVOO hergestellt. Um den besten Anfangspunkt zu finden und in dem Wissen, dass wir höhere Temperaturen untersuchen wollten und nicht bei der ursprünglich veröffentlichten Temperatur von 85 °C beginnen mussten, wurden die Injektor- und Ofentemperaturen schrittweise um 5 °C von 95 °C auf 120 °C erhöht. Die Analyse wurde auf dem Single-Quad-MS durchgeführt, und die im SIM-Modus erhaltenen Peaks wurden in Bezug auf Peakbreite und Auflösung verglichen. Für Vergleichszwecke testeten wir die Split-Injektion und die splitlose Injektion.

Tabelle III: Peakeigenschaften des PBA-derivatisierten 3-MCPD bei unterschiedlichen Anfangstemperaturen des Ofens und des PTV-Injektors

Bei der splitlosen Injektion waren die Peaks für beide Verbindungen über den Bereich von 105-110 °C schmal, während die Peakbreiten bei 100 °C und darüber im Split-Modus praktisch unverändert blieben (Tabelle III). Die Split-Injektion bietet eine gute Peakform und hat das Potenzial, die Menge des Derivatisierungsreagenzes auf der Säule zu reduzieren; es gäbe allerdings auch Bedenken bezüglich der Erzielung einer ausreichenden Empfindlichkeit, da die Split-Injektion traditionell als Injektionstechnik für höher konzentrierte Proben gilt.

Um die Auswirkung auf die Empfindlichkeit zu bewerten, verglichen wir die Nachweisgrenzen (LODs), die bei Anfangstemperaturen von 110 °C und 120 °C für Splitless-Injektionen und von 120 °C für Split-Injektionen erhalten wurden. Abbildung 3 zeigt den Vergleich der Kalibrierkurven für Splitless- und Split-Injektionen (normalisiert auf die Response eines internen Standards). Die LODs betrugen 0.14 mg/kg für die splitlose Injektion und 0.13 mg/kg für die Split-Injektion. Weder die Steigung noch die LODs werden durch die Injektionstechnik beeinflusst, d.h. die Split-Injektion zeigt die gleiche Performance wie die Splitlos-Injektion. Schmalere Peaks, die bei Split-Injektionen erzeugt werden, sind höher, so dass die zusätzliche Peakhöhe den Verlust der Peakfläche kompensiert.

Der Vergleich zwischen dem PTV-Injektor bei 120 °C und 280 °C und dem regulären Split-Injektor bei 280 °C (Abbildung 4) zeigt ebenfalls keine Auswirkung auf die 3-MCPD Response; die Verwendung eines PTV-Injektors kann jedoch zur Verlängerung der Säulenlebensdauer beitragen, da das PBA nach der Überführung der Analyten auf die Säule weiter verdampfen kann. Eine brauchbare Alternative ist die Verwendung einer Vorsäule (z. B. eine 5 m x 0.25 mm Rxi-Vorsäule [Art.-Nr. 10029] oder eine 10 m x 0.25 mm Rxi-Vorsäule [Art.-Nr. 10059]) anstelle eines PTV-Injektors.

Die Nachweisgrenzen lagen deutlich unter den vorgeschlagenen Grenzwerten für 3-MCPD und Glycidylester (2 bzw. 1 mg/kg). Allerdings gewinnen Glycidylester zunehmend an Aufmerksamkeit, insbesondere wenn es um Säuglings- und Babynahrung geht; deshalb könnte eine empfindlichere Methode notwendig sein. Aus diesem Grund haben wir uns für die Verwendung von GC-MS/MS entschieden (Abbildung 5). Mit GC-MS/MS reduzierte sich instrumentelle Nachweisgrenze auf 0.02 mg/kg. Alternativ dazu hat die niedrigste Kalibrierprobe (12 µg/kg) ein Signal-Rausch-Verhältnis von 5:1 und könnte anstelle einer instrumentellen LOD verwendet werden.

Verwendung von Software zur Untersuchung weiterer Möglichkeiten der Methodenoptimierung

Resteks Online-Version der Pro EZGC- Software ist ein Selektivitäts-Tool, das sich auf eine vorinstallierte Bibliothek von thermodynamischen Retentionsindizes stützt. Damit lassen sich Retentionszeiten vorhersagen und chromatographische Methoden optimieren, ohne Gruppen von Verbindungen unter zahlreichen unterschiedlichen Bedingungen analysieren zu müssen. Die Pro EZGC-Software wählt die stationäre Phase, indem gleichzeitig die Filmdicke, die Temperatur, die Säulenlänge, der Säuleninnendurchmesser und der Fluss eingestellt werden. Benutzer können jede Verbindung separat  eingeben oder umfangreiche Listen von Verbindungen in das Programm kopieren bzw. einfügen.

Zur weiteren Optimierung der GC-Methode erstellten  und verwendeten wir eine neue Pro EZGC Bibliothek, die sich auf MCPD und Glycidylester nach der Hydrolyse und Derivatisierung konzentrierte. Die Glycidylester können entweder als 3-MCPD oder 3-MBPD analysiert werden, die beide Teil des Modells sind. Wenn Sie das selbst versuchen, denken Sie daran, den Säulenausgang auf Vakuum zu setzen! Die zuerst vom Pro EZGC-Tool gelieferte Lösung verwendet eine Temperaturrampe und prognostiziert die Elution des letzten Analyten (3-MBPD) auf einer 20 m x 0.18 mm x 0.18 µm Rxi 17-Sil MS-Säule in ein wenig mehr als 5 Minuten. Wir wollten jedoch das Temperaturprogramm mit zwei Rampen beibehalten; deshalb wählten wir den Anfangspunkt für unsere Originalmethode mit einem verwandten Tool – dem EZGC Methoden-Translator – und verbesserten ihn dann weiter mithilfe des Pro EZGC-Programms. Auf diese Weise erhielten wir ein neues, schnelleres GC-Temperaturprogramm, das alle Analyten in weniger als 5 Minuten analysieren konnte (Abbildung 6).

	Peaks	tR (min)	Conc. (ng/mL)
1.	3-MCPD-d5 PBA derivative	4.143	100
2.	3-MCPD PBA derivative	4.169	200
3.	2-MCPD-d5 PBA derivative	4.388	100
4.	2-MCPD PBA derivative	4.418	100

Column	Rxi-17Sil MS, 20 m, 0.18 mm ID, 0.18 µm (cat.# 14102)
Standard/Sample	See notes
Diluent:	Isooctane
Injection
Inj. Vol.:	1 µL PTV split (split ratio 10:1)
Liner:	Topaz 2.0 mm ID straight inlet liner w/wool (cat.# 23314)
Inlet Temp. Program:	120 °C to 165 °C at 300 °C/min (hold 10 min) to 320 °C at 300 °C/min (hold 8 min)
Oven
Oven Temp.:	120 °C (hold 0.5 min) to 200 °C at 18.5 °C/min to 330 °C at 35 °C/min
Carrier Gas	He, constant flow
Flow Rate:	1 mL/min

Detector	MS
Mode:	SIM
SIM Program:	147, 150, 196, 201 m/z, 50 ms dwell
Transfer Line Temp.:	320 °C
Analyzer Type:	Quadrupole
Source Type:	Inert
Source Temp.:	230 °C
Quad Temp.:	150 °C
Ionization Mode:	EI
Instrument	Agilent 7890A GC & 5975C MSD
Sample Preparation	Standards were derivatized with 20 µL phenylboronic acid (saturated solution in diethyl ether), dried, and then reconstituted in 1 mL isooctane. Final concentrations are given in the peak table.
Notes	Compounds and retention times in the peak list are from the actual chromatographic analysis. PBA derivatives of 3-MBPD-d5 and 3-MBPD were included in the Pro EZGC model, but not in the experimental analysis.

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Schlussfolgerung

Hier untersuchten wir Optimierungsstrategien und entwickelten eine verbesserte, indirekte GC-MS-Methode für die Analyse von 3-MCPD und Glycidylestern, die bessere Peakformen ohne nachteilige Auswirkungen auf die Auflösung ergab. Das empirisch optimierte Temperaturprogramm führte zu Zeiteinsparungen von 8 Minuten pro Analyse, während die Methode, die mit der Chromatogramm-Modellierungssoftware Pro EZGC erstellt wurde, bis zu 20 Minuten einsparen kann. Die Verwendung von Split- anstelle von Splitlos-Injektion hatte keine negativen Auswirkungen auf die Nachweisgrenzen und bietet den Vorteil, die Lebensdauer der Säule potenziell zu verlängern, da weniger Derivatisierungsreagenz in die Säule gelangt. Die Verwendung eines normalen Split/Splitlos-Injektors anstelle eines PTV-Injektors hatte ebenfalls keine negativen Auswirkungen auf die Performance. Es wird jedoch die Verwendung einer Vorsäule empfohlen. Letztlich führte die Verwendung der GC-MS/MS-Methode zu einer signifikanten Verbesserung der Nachweisgrenzen.

Literatur

1. World Health Organization, Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives, November 2016. http://www.fao.org/3/a-bq821e.pdf
2. A.P. Arisseto, W.C. Silva, R.G. Tivanello, K.A. Sampaio, E. Vicente, Recent advances in toxicity and analytical methods of monochloropropanediols and glycidyl fatty acid esters in food, Current Opinion in Food Science 24 (2018) 36-42. https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S2214799318300675
3. T.D. Haines, K.J. Adlaf, R.M. Pierceall, I. Lee, P. Venkitasubramanian, M.W. Collison, Direct determination of MCPD fatty acid esters and glycidyl fatty acid esters in vegetable oils by LC–TOFMS, J Am Oil Chem Soc 88(1) (2011) 1-14. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3022155/
4. European Food Safety Authority, Revised safe intake for 3-MCPD in vegetable oils and food, 10 January 2018. https://www.efsa.europa.eu/en/press/news/180110
5. EU considers maximum limits for 3-MCPD and 3-MPDEs in oils and fats, Oils & Fats International, 23 July 2019. https://www.ofimagazine.com/news/eu-considers-maximum-limits-for-3-mcpd-and-3-mpdes-in-oils-and-fats