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Raptor Biphenyl : colonnes rapides et robustes à la sélectivité éprouvée

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Les colonnes LC Raptor de Restek étaient les premières à associer la rapidité des analyses qu’autorisent les particules superficiellement poreuses ("SPP" ou "core-shell") avec le pouvoir de résolution lié à la grande sélectivité des colonnes USLC (Ultra Selective Liquid Chromatography). Elles permettent des séparations plus faciles avec des temps d’analyse plus courts sur des instruments HPLC standard. La gamme Raptor a ensuite évolué pour appliquer les mêmes caractéristiques de rapidité, d’efficacité et de sélectivité aux analyses UHPLC avec des colonnes contenant des particules de 1.8 μm. Plus d’informations sur les colonnes LC Raptor sur www.restek.com/raptor

En développant cette colonne, la priorité était de proposer une nouvelle version de notre phase Biphenyl, l’une des plus innovantes du marché, particulièrement appréciée pour son aptitude à séparer les composés difficiles à résoudre ou pour lesquels les phases C18 ou de type phényl ne sont pas assez résolutives ou rétentives. Les colonnes Raptor Biphenyl s’avèrent ainsi extrêmement utiles pour obtenir des séparations rapides pour des applications de bioanalyse ou des analyses de substances médicamenteuses et de leurs métabolites, en particulier si celles-ci nécessitent une détection par spectrométrie de masse. La rétention plus forte des composés habituellement peu retenus favorise l’ionisation ; la sélectivité plus élevée évite l’utilisation de phases mobiles complexes peu compatibles avec la détection par MS.

En 2005, Restek a découvert pour la première fois les avantages du ligand Biphenyl et, grâce à son expertise, a pu optimiser les propriétés des phases "SPP" associées à cette phase unique de type phényle afin de répondre aux exigences de rentabilité des laboratoires.

Caractéristiques :

imageoob1p.png

Type de phase stationnaire :

Phényle (L11)

Type de ligand :

Biphenyl

Particules :

Silice de 1.8 μm, 2.7 μm, ou 5 μm superficiellement poreuse ("SPP" ou "core-shell")

Porosité :

90 Å

Surface spécifique :

125 m2/g (1.8 μm),
130 m2/g (2.7 μm),
or 100 m2/g (5 μm)

 

Profil d'interactions :

article-profile-GNBR1891C-01.jpg

Interactions principales :

  • Polarisabilité
  • Dispersion
 

Interaction secondaire :

  • Échange Cationique

Conditions d'utilisation :

Gamme de pH : 1.5–8.0
Température max. : 80 °C
Pression max. : 1 034 bar/15 000 psi* (1.8 μm),
600 bar/8 700 psi (2.7 μm); 400 bar/5 800 psi (5 μm)
* Pour une durée de vie maximale, la pression maximale recommandée pour les particules de
1.8 μm est 830 bar/12 000 psi.

Propriétés :

  • Rétention plus forte des composés dipolaires, insaturés ou conjugués.
  • Plus sélective en association à des phases mobiles à base de méthanol.
  • Plus grande sensibilité en LC-MS.
 

La phase Biphenyl s’impose quand :

  • Une colonne C18 n’est pas suffisamment sélective
  • Une plus forte rétention des composés aromatiques hydrophiles
    est recherchée.
 

Profil de rétention :

article-graph-GNBR1891C-01.jpg

Analytes-cibles :

  • Aromatiques
  • Dipolaires
 

Fonctionnalités des analytes-cibles :

  • Aromatiques hydrophiles
  • Dipôles forts
  • Acides de Lewis
  • Dipolaires, insaturés ou conjugués
  • Composés cycliques avec groupes électroattractifs

Sélectivité plus grande vis-à-vis des composés aromatiques par rapport aux colonnes de type phényl-hexyl conventionnelles

Les colonnes SPP "core-shell" contiennent souvent des phases stationnaires phényl-hexyl mais le ligand Biphenyl innovant mis au point par Restek représente la dernière génération des phases à base de groupements phényl. Il offre une meilleure sélectivité que les phases de type phényl-hexyl du marché vis-à-vis des composés aromatiques [1] et un plus grand degré de dispersion que les phases de type phényle. Les colonnes Raptor Biphenyl permettent ainsi de séparer plus facilement les composés aromatiques (Figures 1 et 2) trop rapidement élués ou difficilement séparables avec des phases de type C18 ou phényle.

1. In-house testing based on: M.R. Euerby, P. Petersson, W. Campbell, W. Roe, Chromatographic classification and comparison of commercially available reversed-phase liquid chromatographic columns containing phenyl moieties using principal component analysis, J. Chromatogr. A 1154 (2007) 138–151.
 

Figure 1 : Les colonnes Raptor Biphenyl offrent une meilleure sélectivité que les colonnes SPP de type phényle vis-à-vis des composés aromatiques.

 

Figure 2: Les colonnes Raptor Biphenyl offrent une rétention plus forte pour les composés avec des groupes électroattractifs. La rétention et l’ordre d'élution sont très différents de ceux d'une phase C18 classique.

cgarm-img
LC_GN0546
PeakstR (min)Conc.
(µg/mL)
1.Benzene1.63500
2.Nitrobenzene2.09100
3.1,3,5-Trinitrobenzene4.83100
4.2,4-Dinitrotoluene5.35100
ColumnRaptor Biphenyl (cat.# 9309A55)
Dimensions:50 mm x 4.6 mm ID
Particle Size:2.7 µm
Temp.:40 °C
Standard/Sample
Diluent:Acetonitrile
Conc.:100-500 µg/mL
Inj. Vol.:1 µL
Mobile PhaseWater:Methanol (50:50)
Flow:1.2 mL/min
DetectorWaters Acquity PDA @ 254 nm
InstrumentWaters ACQUITY UPLC H-Class

Une référence en matière de qualité et de longévité

Pression stable :

L’un des principaux avantages des colonnes "SPP" par rapport aux colonnes conventionnelles à particules complètement poreuses est leur aptitude à réaliser de bonnes séparations rapidement à des vitesses linéaires plus élevées. Des vitesses linéaires importantes peuvent toutefois générer des contrepressions plus fortes. Les colonnes Raptor ont été conçues pour supporter plus durablement que les autres colonnes "SPP" du marché les pressions nécessaires aux analyses rapides (Figure 3).

 

Figure 3 : Soumises à de fortes pressions, les colonnes de type phényl-hexyl du marché voient rapidement leur efficacité s’effondrer, alors que l’efficacité des colonnes Raptor Biphenyl demeure inchangée après 3 000 injections.

 

Reproductibilité :

Les colonnes Raptor Biphenyl offrent une sélectivité exceptionnelle et permettent des analyses rapides de façon reproductible. Leur robustesse et leur répétabilité sont des paramètres essentiels. La silice, le procédé de greffage, le remplissage, la conception des raccords et des frittés, tout a été étudié pour garantir une extraordinaire reproductibilité d’une injection à l’autre (Figure 4) et d’un lot à l’autre (Figure 5), quelles que soient les dimensions de la colonne (Figure 6). Des spécifications de contrôle qualité (CQ) encore plus strictes ont également été adoptées pour assurer la stabilité des temps de rétention, indispensable aux analyses MRM.

Figure 4 :  Avec une colonne Raptor Biphenyl, même après des centaines d’injections, les résultats restent reproductibles.

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LC_CF0565
ColumnRaptor™ Biphenyl (cat.# 9309A1E)
Dimensions:100 mm x 3.0 mm ID
Particle Size:2.7 µm
Temp.:30 °C
Standard/Sample
Diluent:Initial mobile phase
Conc.:50 ng/mL
Inj. Vol.:5 µL
Mobile Phase
A:0.1% Formic acid in water
B:0.1% Formic acid in acetonitrile
Time (min)Flow (mL/min)%A%B
0.000.7006040
3.000.7002080
3.010.7006040
5.000.7006040
DetectorWaters Xevo TQ-S
Ion Mode:ESI+
InstrumentWaters

 

Figure 5 : Parfaite reproductibilité d’un lot de colonnes Raptor Biphenyl à l’autre.

cgarm-img
LC_CF0562
ColumnRaptor™ Biphenyl (cat.# 9309A1E)
Dimensions:100 mm x 3.0 mm ID
Particle Size:2.7 µm
Temp.:30 °C
Standard/Sample
Diluent:Initial mobile phase
Conc.:50 ng/mL
Inj. Vol.:5 µL
Mobile Phase
A:0.1% Formic acid in water
B:0.1% Formic acid in acetonitrile
Time (min)Flow (mL/min)%A%B
0.000.7006040
3.000.7002080
3.010.7006040
5.000.7006040
DetectorWaters Xevo TQ-S
Ion Mode:ESI+
InstrumentWaters

 

Figure 6 : Quelles que soient les dimensions, les colonnes Raptor sont suffisamment robustes pour dépasser largement les 1 000 injections, même soumises aux fortes pressions propres à l’UHPLC.

Conçues pour répondre aux exigences de rentabilité des laboratoires d’analyses

Depuis plus de dix ans, la phase Biphenyl Restek est la phase de choix pour les analyses LC, de par sa forte rétentivité, sa grande sélectivité et sa robustesse, très appréciées pour par exemple la séparation en phase inverse de substances médicamenteuses et de leurs métabolites. Combinant ces qualités aux avantages des particules "SPP", les colonnes Raptor Biphenyl permettent aux laboratoires des analyses encore plus rapides pour une large gamme de molécules.

Screening d’analgésiques dans l’urine en moins de 3.5 minutes

Un screening d’analgésiques peut se révéler difficile à optimiser et à reproduire du fait de la sélectivité insuffisante des phases de type C18 ou phényl-hexyl. La colonne Raptor Biphenyl permet quant à elle un screening en moins de 5 minutes avec une résolution totale des isobares (Figure 7). Avec la plupart des colonnes du marché, les pics traînent, les temps d’analyse sont longs et les coélutions nombreuses. Seule la colonne Raptor Biphenyl offre la sélectivité et les propriétés indispensables à cette analyse difficile.

Figure 7: La colonne Raptor Biphenyl permet un screening en moins de 5 minutes avec une résolution totale des isobares.

Raptor Biphenyl

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LC_CF0568
PeakstR (min)Precursor ionProduct ion 1Product ion 2
1.Morphine*1.34286.2152.3165.3
2.Oxymorphone1.40302.1227.3198.2
3.Hydromorphone*1.52286.1185.3128.2
4.Amphetamine1.62136.091.3119.2
5.Methamphetamine1.84150.091.2119.3
6.Codeine*1.91300.2165.4153.2
7.Oxycodone2.02316.1241.3256.4
8.Hydrocodone*2.06300.1199.3128.3
9.Norbuprenorphine2.59414.183.4101.0
PeakstR (min)Precursor ionProduct ion 1Product ion 2
10.Meprobamate2.61219.0158.497.2
11.Fentanyl2.70337.2188.4105.2
12.Buprenorphine2.70468.3396.4414.5
13.Flurazepam2.73388.2315.2288.3
14.Sufentanil2.77387.2238.5111.3
15.Methadone2.86310.2265.3105.3
16.Carisoprodol2.87261.2176.3158.1
17.Lorazepam3.03321.0275.4303.1
18.Diazepam3.31285.1193.2153.9
*An extracted ion chromatogram (XIC) of the isobars is presented in the inset.
ColumnRaptor Biphenyl (cat.# 9309A5E)
Dimensions:50 mm x 3.0 mm ID
Particle Size:2.7 µm
Temp.:30 °C
Standard/Sample
Diluent:Urine:mobile phase A:mobile phase B (17:76:7)
Conc.:10-100 ng/mL
Inj. Vol.:10 µL
Mobile Phase
A:Water + 0.1% formic acid
B:Methanol + 0.1% formic acid
Time (min)Flow (mL/min)%A%B
0.000.69010
1.500.65545
2.500.60100
3.700.60100
3.710.69010
5.000.69010
DetectorAB SCIEX API 4000 MS/MS
Ion Source:TurboIonSpray®
Ion Mode:ESI+
InstrumentAPI LC-MS/MS
NotesLorazepam was prepared at 100 ng/mL; all other analytes are 10 ng/mL.

Fabricant B SPP Phenyl-Hexyl

cgarm-img
LC_CF0573
ColumnCompetitor SPP Phenyl-Hexyl
Dimensions:50 mm x 4.6 mm ID
Particle Size:2.6 µm
Pore Size:100 Å
Temp.:22 °C
Standard/Sample
Diluent:Urine:mobile phase A:mobile phase B (17:76:7)
Conc.:10-100 ng/mL
Inj. Vol.:10 µL
Mobile Phase
A:Water + 10 mM ammonium formate
B:Methanol + 0.1% formic acid
Time (min)Flow (mL/min)%A%B
0.000.6955
4.000.60100
5.000.60100
5.100.6955
7.000.6955
DetectorAB SCIEX API 4000™ MS/MS
Ion Source:TurboIonSpray®
Ion Mode:ESI+
InstrumentAPI LC-MS/MS
NotesLorazepam was prepared at 100 ng/mL; all other analytes are 10 ng/mL. Column and conditions used were specifically recommended or published by the manufacturer for this assay.

Fabricant B SPP C18

cgarm-img
LC_CF0577
ColumnCompetitor SPP C18
Dimensions:50 mm x 3.0 mm ID
Particle Size:2.6 µm
Pore Size:100 Å
Temp.:25 °C
Standard/Sample
Diluent:Urine:mobile phase A:mobile phase B (17:76:7)
Conc.:10-100 ng/mL
Inj. Vol.:10 µL
Mobile Phase
A:Water + 10 mM ammonium formate
B:Methanol + 0.1% formic acid
Time (min)Flow (mL/min)%A%B
0.000.5955
3.000.50100
4.000.50100
4.100.5955
5.000.5955
DetectorAB SCIEX API 4000™ MS/MS
Ion Source:TurboIonSpray®
Ion Mode:ESI+
InstrumentAPI LC-MS/MS
NotesLorazepam was prepared at 100 ng/mL; all other analytes are 10 ng/mL. Column and conditions used were specifically recommended or published by the manufacturer for this assay.

 

Résolution complète des bisphénols grâce à la sélectivité du ligand Biphenyl, sans ajustement de la phase mobile

Pour les analyses de santé et de sécurité alimentaire comme l'évaluation des bisphénols dans les produits de consommation, la rapidité, la fiabilité et la simplicité sont essentielles. La colonne Raptor Biphenyl est capable de séparer un grand nombre de composés rapidement (par exemple, 15 bisphénols en 8 minutes, voir ci-dessous [Figures 8 et 9]) avec un simple gradient de phases mobiles ne nécessitant AUCUN additif. Lorsqu’un retour à la ligne de base est nécessaire pour la détection en UV ou pour une productivité maximale des analyses en spectrométrie de masse, en particulier si la rapidité, la confiance et la simplicité sont essentielles, la colonne Raptor Biphenyl est le choix idéal.

Figure 8 : Séparation rapide des bisphénols avec une phase mobile SANS additifs.

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LC_FS0518
PeakstR (min)Conc.
(ng/mL)
Precursor IonProduct IonProduct Ion
1.Bisphenol S0.845.00249.2108.192.1
2.Bisphenol F1.62350199.393.1105.1
3.Bisphenol E2.06100213.3198.3197.4
4.Bisphenol A2.50100227.3212.3133.1
5.Bisphenol AF2.712.00335.2265.3177.3
6.Bisphenol B3.13100241.3212.4211.3
7.Bisphenol C3.43350255.3240.4147.3
PeakstR (min)Conc.
(ng/mL)
Precursor IonProduct IonProduct Ion
8.Bisphenol AP3.9825.0289.3274.3273.3
9.Bisphenol Z4.25250267.2173.4145.2
10.Bisphenol G4.72250311.2295.4296.4
11.Bisphenol FL4.9050.0348.8256.2-
12.Bisphenol BP5.1450.0351.2273.3274.3
13.Bisphenol M5.3915.0345.2330.3251.4
14.Bisphenol P5.6750.0345.2330.4315.3
15.Bisphenol PH6.11350379.2209.4364.4
ColumnRaptor Biphenyl (cat.# 9309252)
Dimensions:50 mm x 2.1 mm ID
Particle Size:1.8 µm
Pore Size:90 Å
Temp.:25 °C
Standard/Sample
Diluent:75:25 Water:methanol
Conc.:2.00-350 ng/mL
Inj. Vol.:2 µL
Mobile Phase
A:Water
B:Methanol
Time (min)Flow (mL/min)%A%B
0.000.455050
6.500.451090
6.510.455050
8.000.455050
DetectorMS/MS
Ion Mode:ESI-
Mode:MRM
InstrumentUHPLC

 

Figure 9 : La reproductibilité d’un lot à l’autre implique des performances identiques d’une colonne à l’autre pour les bisphénols et pour de nombreuses autres analyses dans le domaine de la santé et de la sécurité alimentaire.

cgarm-img
LC_FS0519
PeakstR (min)Conc.
(ng/mL)
Precursor IonProduct IonProduct Ion
1.Bisphenol S0.845.00249.2108.192.1
2.Bisphenol F1.62350199.393.1105.1
3.Bisphenol E2.06100213.3198.3197.4
4.Bisphenol A2.50100227.3212.3133.1
5.Bisphenol AF2.712.00335.2265.3177.3
6.Bisphenol B3.13100241.3212.4211.3
7.Bisphenol C3.43350255.3240.4147.3
PeakstR (min)Conc.
(ng/mL)
Precursor IonProduct IonProduct Ion
8.Bisphenol AP3.9825.0289.3274.3273.3
9.Bisphenol Z4.25250267.2173.4145.2
10.Bisphenol G4.72250311.2295.4296.4
11.Bisphenol FL4.9050.0348.8256.2-
12.Bisphenol BP5.1450.0351.2273.3274.3
13.Bisphenol M5.3915.0345.2330.3251.4
14.Bisphenol P5.6750.0345.2330.4315.3
15.Bisphenol PH6.11350379.2209.4364.4
ColumnRaptor Biphenyl (cat.# 9309252)
Dimensions:50 mm x 2.1 mm ID
Particle Size:1.8 µm
Pore Size:90 Å
Temp.:25 °C
Standard/Sample
Diluent:75:25 Water:methanol
Conc.:2.00-350 ng/mL
Inj. Vol.:2 µL
Mobile Phase
A:Water
B:Methanol
Time (min)Flow (mL/min)%A%B
0.000.455050
6.500.451090
6.510.455050
8.000.455050
DetectorMS/MS
Ion Mode:ESI-
Mode:MRM
InstrumentUHPLC

 

Analyse rapide des antibiotiques contenant du soufre

Même avec les particules ultra efficaces utilisées en UHPLC, les colonnes ordinaires de type C18 ou phényle ne permettent pas de séparer les sulfonamides avec retour à la ligne de base. La colonne Raptor Biphenyl offre une meilleure sélectivité qui permet de séparer facilement ces composés difficiles (Figure 10) en moins de 5 minutes.

Figure 10 : L’analyse des sulfonamides ne pose aucun problème, même à des vitesses linéaires élevées. La rétention plus forte du sulfanilamide, habituellement peu retenu, favorise son ionisation.

Raptor Biphenyl

cgarm-img
LC_FF0530
PeakstR (min)
1.Sulfanilamide0.41
2.Sulfadiazine1.59
3.Sulfapyridine1.84
4.Sulfathiazole1.96
5.Sulfamerazine2.14
PeakstR (min)
6.Sulfamethazine2.71
7.Sulfachlorpyridazine3.29
8.Sulfadoxine3.44
9.Sulfisoxazole3.58
10.Sulfadimethoxine3.98
11.Sulfaquinoxaline4.08
ColumnRaptor Biphenyl (cat.# 9309A5E)
Dimensions:50 mm x 3.0 mm ID
Particle Size:2.7 µm
Temp.:20 °C
Standard/Sample
Diluent:0.1% Formic acid in water
Conc.:50 µg/mL
Inj. Vol.:5 µL
Mobile Phase
A:0.1% Formic acid in water
B:0.1% Formic acid in acetonitrile
Time (min)Flow (mL/min)%A%B
0.001.5955
2.001.59010
4.501.56535
4.511.5955
5.501.5955
DetectorWaters Acquity PDA @ 260, 4.8 nm
InstrumentWaters ACQUITY UPLC H-Class

Fabricant B SPP C18

cgarm-img
LC_FF0532
ColumnCompetitor SPP C18
Dimensions:50 mm x 3.0 mm ID
Particle Size:2.6 µm
Pore Size:100 Å
Temp.:20 °C
Standard/Sample
Diluent:0.1% Formic acid in water
Conc.:50 µg/mL
Inj. Vol.:5 µL
Mobile Phase
A:0.1% Formic acid in water
B:0.1% Formic acid in acetonitrile
Time (min)Flow (mL/min)%A%B
0.001.5955
2.001.59010
4.501.56535
4.511.5955
5.501.5955
DetectorWaters Acquity® PDA @ 260, 4.8 nm
InstrumentWaters ACQUITY UPLC H-Class

Fabricant D FPP UHPLC Phenyl-Hexyl

cgarm-img
LC_FF0536
ColumnCompetitor Phenyl-Hexyl
Dimensions:50 mm x 2.1 mm ID
Particle Size:1.7 µm
Temp.:20 °C
Standard/Sample
Diluent:0.1% Formic acid in water
Conc.:50 µg/mL
Inj. Vol.:5 µL
Mobile Phase
A:0.1% Formic acid in water
B:0.1% Formic acid in acetonitrile
Time (min)Flow (mL/min)%A%B
0.000.75955
2.000.759010
4.500.756535
4.510.75955
5.500.75955
DetectorWaters Acquity® PDA @ 260, 4.8 nm
InstrumentWaters ACQUITY UPLC H-Class
NotesFlow rate scaled to particle size.

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GNBR1891C-FR