Raptor Polar X : analysez une large gamme de composés polaires à l’aide d’une nouvelle phase stationnaire hybride

• Pas de dérivation chronophage, ni technique complexe d’appariement d’ions.
• Basculez entre les modes de rétention HILIC et Échange Ionique par de simples changements de phase mobile et avec de courts temps d’équilibration.
• Idéales pour améliorer la sélectivité et la sensibilité des analyses LC-MS.

Simplifiez vos analyses de composés polaires

Analyser des composés polaires en chromatographie liquide a toujours été un défi. Leur faible rétention, leur forme de pics dégradée, le recours à des phases mobiles complexes pas forcément compatibles avec la LC-MS/MS, de longs temps d’équilibration, une faible sensibilité ou encore l’utilisation de dérivations chronophages sont autant de challenges qui impactent l’efficacité et la productivité des laboratoires. Mais le développement d’une nouvelle colonne spécialement conçue pour l’analyse d’une large gamme de composés polaires permet aux analystes de s’affranchir de ces contraintes, en profitant pleinement des capacités de leur équipement.

Utilisez la véritable puissance de la chromatographie

L’un des aspects les plus importants des performances d’une méthode, souvent négligé, est d’utiliser la phase stationnaire adéquate. Pour l’analyse des composés polaires, les colonnes de phase inverse ne fournissent pas assez de rétention sauf à utiliser des phases mobiles complexes ou à dériver l’échantillon pour compenser le manque d’interactions entre les analytes et la colonne. Mais en faisant correspondre les analytes à une phase stationnaire spécialement développée pour leur analyse, vous pourrez éviter les procédures complexes de préparation d’échantillons, diminuer les risques d’erreur et gagner en productivité.

La phase stationnaire de la colonne Raptor Polar X est spécialement conçue pour retenir de façon sélective les analytes polaires grâce à 2 mécanismes de rétention combinés. Cette phase hybride, unique, est idéale pour l’analyse d’une grande variété de composés polaires, notamment lorsqu’elle est couplée à la spectrométrie de masse. Simplifiez vos analyses de composés polaires grâce au pouvoir de résolution des colonnes Restek Raptor Polar X.

Une double sélectivité sur une seule et même colonne

Les approches HILIC (Hydrophilic Interaction LIquid Chromatography) et Échange Ionique sont 2 des mécanismes de rétention les plus utilisés pour retenir et analyser les composés polaires. Restek a développé une nouvelle chimie de phase stationnaire conjuguant ces 2 mécanismes sur un seul et unique greffon. Ce greffon étant combiné à des particules superficiellement poreuses, les colonnes Raptor Polar X retiennent et séparent de manière fiable et efficace une large gamme de composés polaires.

Les colonnes dédiées à une application favorisent souvent l’un ou l’autre des mécanismes et les améliorations obtenues pour certains composés polaires se font au détriment des autres. A l’inverse, la chimie spécifique en cours de brevet de la colonne Raptor X permet l’utilisation indépendante ou simultanée des 2 modes disponibles, offrant une rétention optimale et ajustable (Figure 1). De simples modifications des conditions de phase mobile permettent de basculer d’un mode à l’autre, pour une rétention sélective des composés d’intérêt, sans avoir besoin de longs temps d’équilibration au début et entre chaque analyse.

Comment passer d’un mode de rétention à l’autre ?

Lorsque l’on utilise une phase mobile contenant un fort pourcentage d’acétonitrile et un faible pourcentage d’eau, une couche aqueuse se forme à la surface de la silice dans laquelle les composés polaires peuvent interagir avec le ligand greffé à la surface de la silice (Figure 2). La spécificité du greffon de la nouvelle colonne Raptor Polar X simplifie ces mécanismes, permettant des mises en route et des temps d’équilibration plus rapides que jamais. Cela signifie que les colonnes sont prêtes à être utilisées très rapidement, elles permettent ainsi d’augmenter la cadence des analyses.

Le pourcentage élevé d’acétonitrile dans la phase mobile génère de fortes interactions entre la phase stationnaire et les petits analytes polaires et chargés, offrant une excellente rétention de ces composés. Pour affiner cette rétention, il suffit d’augmenter la quantité de phase aqueuse dans la phase mobile. Les composés polaires et chargés, entraînés par la phase mobile, seront alors élués. Avec l’utilisation d’une phase mobile contenant un pourcentage de phase aqueuse plus important, la rétention due au mécanisme HILIC diminue et les caractéristiques d’Échange Ionique de la phase stationnaire deviennent prépondérantes, favorisant un mécanisme de rétention par Échange Ionique (Figure 3).

Exemple de passage d’un mode de rétention à l’autre

Afin d’illustrer ces principes, la figure 4 montre comment deux types différents de composés polaires interagissent avec la phase stationnaire, et comment leurs réponses peuvent être modifiées par de simples changements de phase mobile. Dans cet exemple, nous avons analysé deux vitamines hydrosolubles : la vitamine B3 (niacine), un acide organique, et la vitamine B1 (thiamine) qui, elle, a une charge positive permanente.

Sur le chromatogramme du haut, une phase mobile avec de forts pourcentages de solvant organique a été utilisée, favorisant le mécanisme de rétention HILIC. En utilisant la colonne Raptor Polar X dans ces conditions, une couche aqueuse se forme rapidement à la surface des particules de silice. Cela permet aux composés polaires présents de se répartir entre la phase organique (acétonitrile) et la phase aqueuse où ils peuvent alors interagir avec la phase stationnaire. Les composés polaires sont retenus sur la phase stationnaire par des interactions hydrophiles mais restent néanmoins élués dans des conditions de phase mobile à fort pourcentage de solvant organique. Les analyses LC-MS/MS sont ici grandement favorisées grâce à une meilleure désolvatation et une efficacité d’ionisation accrue.

Le chromatogramme du bas met en évidence les modifications chromatographiques que l’on peut observer lorsque l’on expérimente un autre mécanisme de rétention en utilisant une phase mobile avec un pourcentage de phase aqueuse plus important. Ces conditions vont favoriser le mécanisme de rétention d’Échange Ionique au détriment du mode HILIC, entrainant une perte de rétention des vitamines B1 et B3. L’ordre d’élution est également modifié dans ces conditions, la vitamine B1 étant moins retenue que la vitamine B3 dans ces conditions d’Échange Ionique.

	Peaks
1.	Vitamin B3
2.	Vitamin B1

Column	Raptor Polar X (cat.# 9311A52)
Dimensions:	50 mm x 2.1 mm ID
Particle Size:	2.7 µm
Temp.:	30 °C
Standard/Sample
Diluent:	0.1% Formic acid in acetonitrile
Mobile Phase
Flow:	0.5 mL/min

Detector	MS/MS
Ion Source:	Electrospray
Ion Mode:	ESI+
Instrument	HPLC
Notes	Mobile phase A: Water, 5 mM ammonium formate, 0.1% formic acid Mobile phase B: Acetonitrile, 0.1% formic acid Top chromatogram: 95% B, 10 min run, 2 μL injection (100 ppm B3, 0.01 ppm B1) Bottom chromatogram: 60% B, 5 min run, 0.5 μL injection (100 ppm B3, 0.1 ppm B1)

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Une rétention hybride vous permettant d’analyser un spectre d’analytes plus large avec une seule et même méthode

Les colonnes HPLC se concentrent généralement sur un seul type d’interactions, au détriment des autres. Cette approche est efficace lorsque les analytes ont des caractéristiques similaires. Cependant, les composés polaires ayant des propriétés chimiques qui varient considérablement, cette stratégie implique de recourir à des méthodes et des colonnes différentes pour chaque type d’analytes. Comme le montrent les exemples suivants, la chimie hybride de la phase stationnaire des colonnes Raptor Polar X est l’alternative idéale de par son profil de rétention "multimode", permettant l’analyse d’une grande variété de composés sur une seule et même méthode.

Liste de contaminants polaires - méthode de type QuPPe

La méthode européenne QuPPe (Quick Polar Pesticides) comprend des composés polaires allant d’herbicides polaires anioniques, tels que le glyphosate et ses composés apparentés, à une variété de contaminants oxychlorés comme le chlorate et le perchlorate. Comme le montre la figure 5, la colonne Raptor Polar X permet de séparer rapidement ce mélange complexe avec un cycle d’analyse de seulement 13 minutes, le dernier composé éluant autour de 10.5 minutes. Cette séparation est réalisée à l’aide de phases mobiles simples, non tamponnées, seulement acidifiées avec 0.5% d’acide formique pour améliorer la forme des pics. La méthode illustrée en figure5 permet également de séparer des composés ayant les mêmes fragments en MS, comme l’AMPA et le N-acetyl AMPA, ou le fosetyl aluminium et les acides phosponique et phosphorique (ce dernier étant reconnu comme une source fréquente d’interférences analytiques).

	Peaks	tR (min)	Conc. (ng/mL)	Precursor Ion	Product Ion 1	Product Ion 2	Product Ion 3	Precursor 2	Product Ion 2
1.	Aminomethylphosphonic acid (AMPA)	0.805	200	110.1	79.1	63.1	81.1	-	-
2.	Bialophos	0.847	100	322.2	88.2	216.1	134.2	-	-
3.	Perchlorate	2.593	5	101.0	84.95	-	-	98.9	83
4.	Glufosinate	3.376	200	180.2	85.2	95.1	-	-	-
5.	3-(Methylphophinico) propionic acid (MPPA)	4.076	100	151.0	63.0	107.1	133.2	-	-
6.	Trifluoracetic acid (TFA)	4.423	20	113.0	69.1	19.1	-	-	-
7.	2-Hydroxyethane phosphonic acid (HEPA)	4.969	100	125.1	79.0	95.0	63	-	-
8.	Difluoroacetic acid (DFA)	5.018	200	95.0	51.1	-	-	-	-
9.	Chlorate	5.542	100	85.0	69.0	-	-	83.0	67.1
10.	Ethephon	5.564	200	143.1	107.2	-	-	-
11.	Glyphosate	6.113	200	168.1	63.1	79.1	-	-	-
12.	Bromide	6.423	2000	80.9	80.9	-	-	79.0	79.0
13.	Bromate	6.771	600	129.0	113	-	-	127	111.1
14.	N-acetyl AMPA	6.932	200	152.1	110.1	62.9	-	-	-
15.	Fosetyl aluminum	7.775	80	109.1	81.0	63.0	78.9	-	-
16.	Phosphonic acid	8.275	500	81.1	62.9	-	-	-	-
17.	N-acetyl glufosinate	9.980	200	222.2	136.1	134.1	59.0	-	-

Column	Raptor Polar X (cat.# 9311A32)
Dimensions:	30 mm x 2.1 mm ID
Particle Size:	2.7 µm
Pore Size:	90 Å
Temp.:	35 °C
Standard/Sample
Diluent:	Water
Inj. Vol.:	1 µL
Mobile Phase
A:	Water, 0.5% formic acid
B:	Acetonitrile, 0.5% formic acid
	Time (min) Flow (mL/min) %A %B 0.00 0.5 35 65 5.0 0.5 90 10 11.5 0.5 90 10 11.51 0.5 35 65 13 0.5 35 65

Detector	MS/MS
Ion Mode:	ESI-
Mode:	MRM
Instrument	UHPLC

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En plus de la méthode développée par Restek, illustrée en figure 5, les précolonnes et colonnes analytiques Raptor Polar X ont chacune été évaluées et incluses dans la méthode QuPPe elle-même [1]. Elles sont utilisées dans une méthode de détection par LC-MS/MS en mode ESI négatif d’une grande variété de pesticides polaires.

Acides aminés non-dérivés

Les acides aminés sont un groupe hétérogène de composés polaires, généralement analysés en phase inverse ou par Échange Ionique en utilisant des dérivations pré- ou post-colonne. L’analyse directe des acides aminés non-dérivés est difficile en raison d’une faible rétention et de performances chromatographiques médiocres. Cependant, les acides aminés non-dérivés avec des chaînes latérales polaires, non polaires, chargées positivement ou négativement sont tous retenus et très bien séparés sur une seule et même méthode avec la colonne Raptor Polar X. La figure 6 montre l’analyse de 21 acides aminés, non dérivés, incluant un supplément de taurine, dans une préparation pour nourrissons, après une simple précipitation de protéines et analyse directe de l’extrait.

	Peaks	tR (min)	Precursor Ion	Product Ion
1.	Tryptophan	1.17	205.07	146.08
2.	Phenylalanine	1.26	166.13	120.10
3.	Leucine	1.41	132.13	86.10
4.	Isoleucine	1.55	132.13	86.10
5.	Methionine	1.62	150.07	104.10
6.	Tyrosine	1.69	182.10	136.08
7.	Taurine	1.91	126.07	108.07
8.	Valine	1.98	118.13	72.11
9.	Proline	2.29	116.13	70.09
10.	Alanine	3.00	90.03	44.10

	Peaks	tR (min)	Precursor Ion	Product Ion
11.	Threonine	3.12	120.13	74.08
12.	Glycine	3.62	76.10	30.11
13.	Glutamine	3.87	147.13	84.07
14.	Serine	3.93	106.07	60.09
15.	Asparagine	4.08	133.13	74.07
16.	Arginine	4.47	175.17	70.09
17.	Histidine	4.66	156.07	110.16
18.	Lysine	4.97	147.13	84.13
19.	Glutamic acid	5.89	148.10	84.10
20.	Cystine	6.10	241.13	152.00
21.	Aspartic acid	7.12	134.07	74.06

Column	Raptor Polar X (cat.# 9311A12)
Dimensions:	100 mm x 2.1 mm ID
Particle Size:	2.7 µm
Temp.:	30 °C
Standard/Sample
Diluent:	20:80 Water:acetonitrile, 0.01 N HCl
Conc.:	Endogenous amino acids
Inj. Vol.:	5 µL
Mobile Phase
A:	Water, 0.5% formic acid
B:	Mobile Phase B: 9:1 Acetonitrile:20 mM ammonium formate in water (pH 3.0) (The ammonium formate concentration is 20 mM relative to the total volume of mobile phase B. See preparation notes for instructions on diluting a 200 mM aqueous starting solution.)
	Time (min) Flow (mL/min) %A %B 0.00 0.5 12 88 3.50 0.5 12 88 8.00 0.5 70 30 8.01 0.5 12 88 10.0 0.5 12 88

Detector	MS/MS
Ion Mode:	ESI+
Mode:	MRM
Instrument	UHPLC
Sample Preparation	A 200 µL aliquot of protein hydrolysate formula (Similac ALIMENTUM) was mixed with 800 µL of acetonitrile and 10 µL of 1 N HCl. After centrifugation at 4000 rpm for 5 minutes, the supernatant was diluted 20-fold with 20:80 water:acetonitrile (0.01 N HCl) and injected for analysis.
Notes	Mobile Phase B Preparation: To make 500 mL of mobile phase B, measure ~45 mL of water into a small beaker and add 1 mL of 10 M ammonium formate solution. Adjust pH to 3.0 by adding formic acid and then bring the volume to 50 mL with water. Combine this 50 mL ammonium formate solution (pH 3.0) with 450 mL of acetonitrile to complete the preparation.

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PFAS à chaînes ultra-courtes et chaînes longues

Le dernier exemple de la capacité de la colonne Raptor Polar X à maximiser la productivité d’une méthode est une application qui ouvre la voie à de nouveaux tests. Les méthodes LC-MS/MS actuelles pour l’analyse des PFAS ("PolyFluoroAlkyl Substances") se focalisent sur les chaînes courtes (C4 – C6), les chaînes longues (C8 et au-delà) et les composés alternatifs mais elles n’incluent pas les composés émergents à chaînes ultra-courtes (C2 et C3). Les méthodes actuelles en phase inverse ne fournissent pas assez de rétention pour les PFAS à chaînes ultra-courtes, tandis que les méthodes d’échange anionique en fournissent trop, avec pour résultat des performances chromatographiques médiocres. Grâce au double mécanisme de rétention de la colonne Raptor Polar X, les PFAS à chaînes ultra-courtes et ceux à chaînes longues peuvent tous être analysés sur une même méthode isocratique de 5 minutes (Figure 7).

	Peaks	tR (min)	Conc. (ng/L)	Precursor Ion	Product Ion
1.	11-Chloroeicosafluoro-3-oxanonane-1-sulfonate (11CL-PF3OUdS)	1.25	400	630.78	450.80
2.	9-Chlorohexadecafluoro-3-oxanonane-1-sulfonate (9Cl-PF3ONS)	1.34	400	530.78	350.85
3.	Perfluorooctanesulfonic acid (PFOS)	1.38	400	498.84	79.97
4.	Perfluorohexanesulfonic acid (PFHxS)	1.49	400	398.90	79.97
5.	Perfluorobutanesulfonic acid (PFBS)	1.64	400	298.97	79.97
6.	Perfluoropropanesulfonic acid (PFPrS)	1.73	400	248.97	79.98
7.	Perfluoroethanesulfonic acid (PFEtS)	1.86	400	198.98	79.92

	Peaks	tR (min)	Conc. (ng/L)	Precursor Ion	Product Ion
8.	Hexafluoropropylene oxide dimer acid (HFPO-DA)	2.06	400	284.97	168.92
9.	Perfluorooctanoic acid (PFOA)	2.11	400	412.90	368.91
10.	Ammonium 4,8-dioxa-3H-perfluorononanoate (ADONA)	2.15	400	376.90	250.93
11.	Perfluorohexanoic acid (PFHxA)	2.36	400	312.97	268.90
12.	Perfluorobutanoic acid (PFBA)	2.76	400	212.97	168.97
13.	Perfluoropropionic acid (PFPrA)	3.06	400	163.03	119.01
14.	Trifluoroacetic acid (TFA)	3.77	400	113.03	69.01

Column	Raptor Polar X (cat.# 9311A52)
Dimensions:	50 mm x 2.1 mm ID
Particle Size:	2.7 µm
Temp.:	40 °C
Standard/Sample
Diluent:	50:50 Water:methanol
Conc.:	400 ng/L
Inj. Vol.:	10 µL
Mobile Phase
A:	Water, 10 mM ammonium formate, 0.05% formic acid
B:	60:40 Acetonitrile:methanol, 0.05% formic acid
	Time (min) Flow (mL/min) %A %B 0.00 0.5 15 85 8.00 0.5 15 85

Detector	MS/MS
Ion Mode:	ESI-
Mode:	MRM
Instrument	UHPLC

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Passiver le système : est-ce nécessaire ?

Le glyphosate peut être difficile à analyser à l’état de traces car il se chélate aux ions métalliques présents dans le système LC. La colonne Raptor X est livrée déjà traitée et prête à l’emploi, mais il peut être utile de passiver les autres composés métalliques de votre système LC en contact avec l’échantillon. La nécessité d’une passivation dépendra de l’application et de la configuration de votre système LC, mais pour l’analyse de composés polaires connus pour se chélater, tel que le glyphosate, Restek recommande de traiter votre système avec une solution de passivation LC (réf. 32475) avant d’effectuer vos analyses.

Une nouvelle phase stationnaire développée selon les critères de qualité stricts des colonnes de la gamme Raptor

La colonne Raptor Polar X a été conçue, fabriquée et testée selon les mêmes standards rigoureux qui ont fait des colonnes Raptor un synonyme de qualité. Qu’il s’agisse de leur répétabilité sans faille (injection après injection) lors d’analyses d’échantillons réels dans des matrices complexes comme les épinards (figure 8), ou de leur parfaite reproductibilité (colonne à colonne, lot à lot) quand il est finalement temps de changer la colonne (figure 9), vous pouvez toujours compter sur la qualité de la gamme Raptor. De plus, le recours à un ligand unique pour la rétention hybride de la colonne Raptor Polar X permet de garantir que chaque colonne est fabriquée de façon uniforme et peut résister à des conditions agressives comme des injections de larges volumes d’eau, sans perte de phase stationnaire.

	Peaks	Conc. (ng/mL)	Precursor Ion	Product Ion 1	Product Ion 2	Product Ion 3
1.	AMPA	100	110.10	79.05	63.10	81.10
2.	Glufosinate	100	180.20	85.15	95.10	-
3.	Glyphosate	100	168.10	63.05	79.05	-

Column	Raptor Polar X (cat.# 9311A32)
Dimensions:	30 mm x 2.1 mm ID
Particle Size:	2.7 µm
Pore Size:	90 Å
Guard Column:	Raptor Polar X guard column cartridge 5 mm, 2.1 mm ID, 2.7 µm (cat.# 9311A0252)
Temp.:	35 °C
Standard/Sample	Spinach extract
Inj. Vol.:	2 µL
Mobile Phase
A:	Water, 0.5% formic acid
B:	Acetonitrile, 0.5% formic acid
	Time (min) Flow (mL/min) %A %B 0.00 0.5 35 65 5.0 0.5 90 10 6.5 0.5 90 10 6.51 0.5 35 65 8 0.5 35 65

Detector	MS/MS
Ion Mode:	ESI-
Mode:	MRM
Instrument	UHPLC
Sample Preparation	Frozen spinach was added to a Blixer processor with dry ice (3:1-4:1 ratio) and then ground into a very fine powder. The homogenate was placed into the freezer immediately. A 5.0 gram sample of the spinach powder was weighed into a 50 mL centrifuge tube (cat.# 25846). According to the QuPPe method (Quick Polar Pesticides Method), 5.0 mL of methanol with 1.0% formic acid was added into the centrifuge tube. The tube was shaken by hand for 1 min and then by a mechanical shaker vigorously for 5 min. After centrifuging for 10 min at 4200 rpm, the supernatant was filtered through a 0.22 μm filter (cat.# 23984). The final extract was fortified with the AMPA, glufosinate, and glyphosate at a final concentration of 100 ng/mL.

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	Peaks	Conc. (ng/mL)	Precursor Ion	Product Ion 1	Product Ion 2	Product Ion 3
1.	AMPA	100	110.10	79.05	63.10	81.10
2.	Glufosinate	100	180.20	85.15	95.10	-
3.	Glyphosate	100	168.10	63.05	79.05	-

Column	Raptor Polar X (cat.# 9311A32)
Dimensions:	30 mm x 2.1 mm ID
Particle Size:	2.7 µm
Pore Size:	90 Å
Temp.:	35 °C
Standard/Sample
Diluent:	Water
Inj. Vol.:	5 µL
Mobile Phase
A:	Water, 0.5% formic acid
B:	Acetonitrile, 0.5% formic acid
	Time (min) Flow (mL/min) %A %B 0.00 0.5 35 65 5.0 0.5 90 10 6.5 0.5 90 10 6.51 0.5 35 65 8 0.5 35 65

Detector	MS/MS
Ion Mode:	ESI-
Mode:	MRM
Instrument	UHPLC

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Colonnes Raptor Polar X : une révolution dans l’analyse des composés polaires

L’analyse des composés polaires s’est jusqu’à présent révélée comme étant un défi pour la qualité des données et la productivité des laboratoires : signal faible, procédures complexes de préparation d’échantillons, faible rétention... Les colonnes Raptor Polar X, grâce à leur nouvelle chimie de phase stationnaire permettant les modes HILIC et Échange Ionique sur un seul greffon, simplifient considérablement l’analyse de ces composés complexes et variés. En greffant ce ligand unique sur des particules superficiellement poreuses (SPP), Restek a créé une phase qui retient et sépare efficacement un large spectre de composés polaires. La synergie de ces caractéristiques fournit aux scientifiques de toutes industries un outil polyvalent, puissant et productif.

Références

1. M. Anastassiades, A.-K. Wachtler, D. I. Kolberg, E. Eichhorn, H. Marks, A. Benkenstein, S. Zechmann; D. Mack, C. Wildgrube, A. Barth, I. Sigalov, S. Görlich, D. Dörk, G. Cerchia, Quick method for the analysis of highly polar pesticides in food involving extraction with acidified methanol and LC - or ICMS/MS Measurement - I. Food of Plant Origin (QuPPe-PO-Method)–Version 12 (published on EURL-SRM website on July 23, 2021). https://www.eurl-pesticides.eu/docs/public/tmplt_article.asp?LabID=200&CntID=1115&Theme_ID=1&Pdf=False&Lang=EN