Raptor Polar X: Separa una vasta gamma di analiti polari con un’innovativa fase stazionaria ibrida

• Ideale per evitare lunghi processi di derivatizzazione o complessi accoppiamenti ionici.
• Possibilità di passare da una modalità di ritenzione a un’altra con semplici modifiche della fase mobile e con tempi di equilibratura brevi.
• Ideale per aumentare la sensibilità e la selettività delle analisi LC-MS.

Semplifica l’analisi dei composti polari

Analizzare i composti polari utilizzando la cromatografia liquida è da sempre una procedura impegnativa. Scarsa ritenzione e forma del picco, fasi mobili complesse che potrebbero essere incompatibili con MS, lunghi tempi di equilibratura, scarsa sensibilità e necessità di derivatizzare il campione sono tutte criticità che riducono la produttività e l’efficienza del laboratorio. Lo sviluppo di un’innovativa colonna studiata appositamente per l’analisi di una vasta gamma di composti polari consente agli scienziati di evitare queste problematiche sfruttando appieno le potenzialità della cromatografia.

La vera forza della cromatografia

Uno degli aspetti più significativi, ma meno compresi, che influenzano le prestazioni del metodo è l’importanza di utilizzare la fase stazionaria adatta a una particolare separazione. Per l’analisi dei composti polari, le colonne a fase inversa non offrono un’adeguata ritenzione se non con il ricorso a fasi mobili complesse o alla derivatizzazione del campione per compensare la mancanza di interazioni efficaci tra gli analiti e la colonna. Tuttavia, abbinare gli analiti a una fase stazionaria con un potere risolutivo ad hoc permetterà di evitare complesse procedure di preparazione del campione, risparmiare tempo e denaro e ridurre il rischio di errore.

La fase stazionaria delle colonne Raptor Polar X è studiata appositamente per la ritenzione selettiva degli analiti polari attraverso il bilanciamento di due meccanismi di ritenzione. Si tratta di una fase ibrida e unica, che è la soluzione ideale per analizzare una vasta gamma di composti polari, soprattutto quando accoppiata alla spettrometria di massa. Semplifica l’analisi dei composti polari grazie alla selettività unica garantita dalle colonne Raptor Polar X di Restek.

Un potenziale che va oltre i singoli vantaggi

Consapevole che i meccanismi di ritenzione più usati per i composti polari sono la cromatografia a interazione idrofilica (HILIC) e lo scambio ionico, Restek ha sviluppato un’innovativa fase stazionaria che combina entrambe le modalità in un unico ligando. Poiché quest’unico ligando si lega alle particelle superficialmente porose, le colonne Raptor Polar X sono in grado di effettuare una ritenzione affidabile e una separazione efficiente di una vasta gamma di analiti polari.

Le colonne tradizionali ad applicazione specifica favoriscono in genere un solo metodo di ritenzione, e i vantaggi nella ritenzione di un tipo di composto polare sono conquistati a discapito della performance relativa agli altri. Ora invece, grazie all’innovativa fase della colonna Raptor Polar X (in attesa di brevetto) sono disponibili due meccanismi di ritenzione indipendenti per una ritenzione flessibile e perfettamente bilanciata (Figura 1). Semplici variazioni nelle condizioni della fase mobile permettono agli analisti di passare da una modalità all’altra e regolare in modo selettivo la ritenzione per i composti d’interesse senza dover attendere i lunghi tempi di equilibratura prima dell’utilizzo o tra un campione e l’altro.

Funzionamento: da una modalità di ritenzione all’altra

When using a mobile phase with a relatively high-percentage of acetonitrile to water, a layer of water is formed at the surface of the silica into which polar compounds can partition. Partitioning into the water layer results in effective interactions between polar analytes and the ligand bound to the silica surface (Figure 2). The novel Raptor Polar X ligand chemistry makes this technique even easier, allowing for faster-than-ever column equilibration and re-equilibration. This means new columns are ready for use quickly, and sample throughput increases because less re-equilibration time is required between samples.

Per i composti polari di dimensioni inferiori, questa elevata percentuale di acetonitrile genera forti interazioni tra gli analiti e la fase stazionaria, dando luogo a un’ottima ritenzione dei composti piccoli, molto polari e caricati. Per regolare la ritenzione basta semplicemente aumentare la quantità di acqua nella fase mobile. Questo trascinerà i composti polari caricati nella fase mobile, consentendone un’efficace eluizione. Passando a una fase mobile con una percentuale più elevata di acqua, la ritenzione dovuta alla partizione HILIC diminuirà e le caratteristiche di scambio ionico della fase stazionaria si riveleranno il meccanismo di ritenzione prevalente (Figura 3).

Cambio della modalità di ritenzione: un esempio

Per illustrare l’azione di questi principi, la Figura 4 mostra come due tipi diversi di composti polari interagiscono con la fase stazionaria e come le loro risposte sono influenzate da semplici variazioni della fase mobile. In questo esempio, abbiamo analizzato due vitamine idrosolubili: la vitamina B3 (niacina), che è un acido organico, e la vitamina B1 (tiamina), che ha una carica positiva permanente.

Nel cromatogramma in alto è stata utilizzata una fase mobile altamente organica, che favorisce la separazione HILIC. Utilizzando la colonna Raptor Polar X con queste condizioni, si forma rapidamente uno strato acquoso sulla superficie delle particelle di silice. Questo favorisce la partizione dei composti polari dallo strato di acetonitrile nello strato acquoso, dove questi possono anche interagire con la superficie della silice e la fase stazionaria. In questo modo, i composti polari vengono trattenuti grazie alle interazioni idrofiliche con la fase stazionaria e vengono ancora eluiti in condizioni di fase mobile altamente organica. Ciò è di grande aiuto per l’analisi LC-MS/MS grazie alla migliore desolvatazione e a una maggiore efficienza della ionizzazione.

Il cromatogramma in basso evidenzia i cambiamenti cromatografici rilevati quando si cambia il meccanismo di ritenzione passando a una fase mobile con una percentuale di acqua più elevata. Più ci allontaniamo dalle condizioni ideali per la HILIC, meno vengono trattenute sia la vitamina B1 che la vitamina B3. Questo è dovuto al fatto che, con l’aumento della percentuale di acqua nella fase mobile, le condizioni si allontanano dalla ritenzione HILIC per avvicinarsi alle caratteristiche di ritenzione a scambio ionico. Anche l’ordine di eluizione cambia perché in condizioni di scambio ionico la vitamina B1 è meno trattenuta della vitamina B3.

	Peaks
1.	Vitamin B3
2.	Vitamin B1

Column	Raptor Polar X (cat.# 9311A52)
Dimensions:	50 mm x 2.1 mm ID
Particle Size:	2.7 µm
Temp.:	30 °C
Standard/Sample
Diluent:	0.1% Formic acid in acetonitrile
Mobile Phase
Flow:	0.5 mL/min

Detector	MS/MS
Ion Source:	Electrospray
Ion Mode:	ESI+
Instrument	HPLC
Notes	Mobile phase A: Water, 5 mM ammonium formate, 0.1% formic acid Mobile phase B: Acetonitrile, 0.1% formic acid Top chromatogram: 95% B, 10 min run, 2 μL injection (100 ppm B3, 0.01 ppm B1) Bottom chromatogram: 60% B, 5 min run, 0.5 μL injection (100 ppm B3, 0.1 ppm B1)

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Una ritenzione ibrida ben bilanciata permette di analizzare più composti utilizzando un unico metodo

In genere le colonne hanno un uso specifico, concentrandosi su un tipo di interazione ben determinato ed escludendo le altre modalità di interazione. Questo approccio funziona bene quando tutti gli analiti target hanno le stesse caratteristiche; tuttavia, i composti polari hanno tratti chimici ampiamente differenti. Nell’analisi dei composti polari, un approccio specifico nella scelta della colonna spesso si traduce nel dover utilizzare più metodi diversi con colonne o condizioni diverse a seconda dell’analita. Come mostrano gli esempi che seguono, la fase ibrida delle colonne Raptor Polar X è un’alternativa migliore perché il profilo di ritenzione multimodale permette di analizzare una vasta gamma di analiti target con lo stesso metodo.

Lista di contaminanti polari ispirata al metodo QuPPe

Il metodo europeo QuPPe (Quick Polar Pesticides) include una varietà di analiti polari, dagli erbicidi polari anionici, come il glifosato e composti correlati, a tutta una serie di oxicloro contaminanti, tra cui il clorato e il perclorato. Come mostra la Figura 5, la colonna Raptor Polar X trattiene e separa rapidamente questo mix eterogeneo, in cui l’ultimo composto eluisce in circa 10,5 minuti e con un tempo totale di corsa di soli 13 minuti. Questa separazione viene eseguita con fasi mobili semplici senza tampone, acidificate con lo 0,5% di acido formico per ridurre l’allargamento e lo scodamento del picco. Il metodo mostrato nella Figura 5 ha permesso anche la separazione dei composti con frammenti di massa simile, come l’AMPA dall’N-acetile AMPA e il fosetil alluminio da acido fosfonico e acido fosforico (un componente della matrice comunemente osservato e fonte di interferenza).

	Peaks	tR (min)	Conc. (ng/mL)	Precursor Ion	Product Ion 1	Product Ion 2	Product Ion 3	Precursor 2	Product Ion 2
1.	Aminomethylphosphonic acid (AMPA)	0.805	200	110.1	79.1	63.1	81.1	-	-
2.	Bialophos	0.847	100	322.2	88.2	216.1	134.2	-	-
3.	Perchlorate	2.593	5	101.0	84.95	-	-	98.9	83
4.	Glufosinate	3.376	200	180.2	85.2	95.1	-	-	-
5.	3-(Methylphophinico) propionic acid (MPPA)	4.076	100	151.0	63.0	107.1	133.2	-	-
6.	Trifluoracetic acid (TFA)	4.423	20	113.0	69.1	19.1	-	-	-
7.	2-Hydroxyethane phosphonic acid (HEPA)	4.969	100	125.1	79.0	95.0	63	-	-
8.	Difluoroacetic acid (DFA)	5.018	200	95.0	51.1	-	-	-	-
9.	Chlorate	5.542	100	85.0	69.0	-	-	83.0	67.1
10.	Ethephon	5.564	200	143.1	107.2	-	-	-
11.	Glyphosate	6.113	200	168.1	63.1	79.1	-	-	-
12.	Bromide	6.423	2000	80.9	80.9	-	-	79.0	79.0
13.	Bromate	6.771	600	129.0	113	-	-	127	111.1
14.	N-acetyl AMPA	6.932	200	152.1	110.1	62.9	-	-	-
15.	Fosetyl aluminum	7.775	80	109.1	81.0	63.0	78.9	-	-
16.	Phosphonic acid	8.275	500	81.1	62.9	-	-	-	-
17.	N-acetyl glufosinate	9.980	200	222.2	136.1	134.1	59.0	-	-

Column	Raptor Polar X (cat.# 9311A32)
Dimensions:	30 mm x 2.1 mm ID
Particle Size:	2.7 µm
Pore Size:	90 Å
Temp.:	35 °C
Standard/Sample
Diluent:	Water
Inj. Vol.:	1 µL
Mobile Phase
A:	Water, 0.5% formic acid
B:	Acetonitrile, 0.5% formic acid
	Time (min) Flow (mL/min) %A %B 0.00 0.5 35 65 5.0 0.5 90 10 11.5 0.5 90 10 11.51 0.5 35 65 13 0.5 35 65

Detector	MS/MS
Ion Mode:	ESI-
Mode:	MRM
Instrument	UHPLC

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Oltre al metodo sviluppato da Restek illustrato nella Figura 5, anche le colonne analitiche e le precolonne Raptor Polar X sono state sottoposte a valutazione indipendente e incluse nel metodo QuPPe [1]. Vengono impiegate in un metodo per la rilevazione di una vasta gamma di pesticidi polari in LC-MS/MS in modalità ESI(-).

Amminoacidi non derivatizzati

Amino acids are a diverse group of very polar compounds that are commonly analyzed with reversed-phase or ion-exchange chromatography using pre- or post-column derivatization. Direct analysis of underivatized amino acids is challenging due to limited retention and poor chromatographic performance. However, underivatized amino acids with nonpolar, polar, positively charged, and negatively charged side chains are all retained and easily separated in one method on a Raptor Polar X column. Figure 6 shows the analysis of 21 amino acids, including a taurine supplement, in a liquid baby formula matrix using a simple protein precipitation and direct analysis of the resulting extract.

	Peaks	tR (min)	Precursor Ion	Product Ion
1.	Tryptophan	1.17	205.07	146.08
2.	Phenylalanine	1.26	166.13	120.10
3.	Leucine	1.41	132.13	86.10
4.	Isoleucine	1.55	132.13	86.10
5.	Methionine	1.62	150.07	104.10
6.	Tyrosine	1.69	182.10	136.08
7.	Taurine	1.91	126.07	108.07
8.	Valine	1.98	118.13	72.11
9.	Proline	2.29	116.13	70.09
10.	Alanine	3.00	90.03	44.10

	Peaks	tR (min)	Precursor Ion	Product Ion
11.	Threonine	3.12	120.13	74.08
12.	Glycine	3.62	76.10	30.11
13.	Glutamine	3.87	147.13	84.07
14.	Serine	3.93	106.07	60.09
15.	Asparagine	4.08	133.13	74.07
16.	Arginine	4.47	175.17	70.09
17.	Histidine	4.66	156.07	110.16
18.	Lysine	4.97	147.13	84.13
19.	Glutamic acid	5.89	148.10	84.10
20.	Cystine	6.10	241.13	152.00
21.	Aspartic acid	7.12	134.07	74.06

Column	Raptor Polar X (cat.# 9311A12)
Dimensions:	100 mm x 2.1 mm ID
Particle Size:	2.7 µm
Temp.:	30 °C
Standard/Sample
Diluent:	20:80 Water:acetonitrile, 0.01 N HCl
Conc.:	Endogenous amino acids
Inj. Vol.:	5 µL
Mobile Phase
A:	Water, 0.5% formic acid
B:	Mobile Phase B: 9:1 Acetonitrile:20 mM ammonium formate in water (pH 3.0) (The ammonium formate concentration is 20 mM relative to the total volume of mobile phase B. See preparation notes for instructions on diluting a 200 mM aqueous starting solution.)
	Time (min) Flow (mL/min) %A %B 0.00 0.5 12 88 3.50 0.5 12 88 8.00 0.5 70 30 8.01 0.5 12 88 10.0 0.5 12 88

Detector	MS/MS
Ion Mode:	ESI+
Mode:	MRM
Instrument	UHPLC
Sample Preparation	A 200 µL aliquot of protein hydrolysate formula (Similac ALIMENTUM) was mixed with 800 µL of acetonitrile and 10 µL of 1 N HCl. After centrifugation at 4000 rpm for 5 minutes, the supernatant was diluted 20-fold with 20:80 water:acetonitrile (0.01 N HCl) and injected for analysis.
Notes	Mobile Phase B Preparation: To make 500 mL of mobile phase B, measure ~45 mL of water into a small beaker and add 1 mL of 10 M ammonium formate solution. Adjust pH to 3.0 by adding formic acid and then bring the volume to 50 mL with water. Combine this 50 mL ammonium formate solution (pH 3.0) with 450 mL of acetonitrile to complete the preparation.

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Ultrashort- to Long-Chain PFAS

Gli amminoacidi sono un gruppo variegato di composti molto polari comunemente analizzati in cromatografia a fase inversa o a scambio ionico, utilizzando la derivatizzazione pre- o post-colonna. L’analisi diretta degli amminoacidi non derivatizzati è complessa a causa della ritenzione limitata e della scarsa prestazione cromatografica. Tuttavia, gli amminoacidi non derivatizzati con catene laterali non polari, polari, con carica positiva e con carica negativa vengono tutti trattenuti e separati facilmente in un unico metodo sulla colonna Raptor Polar X. La Figura 6 mostra l’analisi di 21 amminoacidi, incluso un supplemento di taurina, nella matrice liquida di un latte artificiale per bambini utilizzando una semplice precipitazione delle proteine e l’analisi diretta dell’estratto risultante.

	Peaks	tR (min)	Conc. (ng/L)	Precursor Ion	Product Ion
1.	11-Chloroeicosafluoro-3-oxanonane-1-sulfonate (11CL-PF3OUdS)	1.25	400	630.78	450.80
2.	9-Chlorohexadecafluoro-3-oxanonane-1-sulfonate (9Cl-PF3ONS)	1.34	400	530.78	350.85
3.	Perfluorooctanesulfonic acid (PFOS)	1.38	400	498.84	79.97
4.	Perfluorohexanesulfonic acid (PFHxS)	1.49	400	398.90	79.97
5.	Perfluorobutanesulfonic acid (PFBS)	1.64	400	298.97	79.97
6.	Perfluoropropanesulfonic acid (PFPrS)	1.73	400	248.97	79.98
7.	Perfluoroethanesulfonic acid (PFEtS)	1.86	400	198.98	79.92

	Peaks	tR (min)	Conc. (ng/L)	Precursor Ion	Product Ion
8.	Hexafluoropropylene oxide dimer acid (HFPO-DA)	2.06	400	284.97	168.92
9.	Perfluorooctanoic acid (PFOA)	2.11	400	412.90	368.91
10.	Ammonium 4,8-dioxa-3H-perfluorononanoate (ADONA)	2.15	400	376.90	250.93
11.	Perfluorohexanoic acid (PFHxA)	2.36	400	312.97	268.90
12.	Perfluorobutanoic acid (PFBA)	2.76	400	212.97	168.97
13.	Perfluoropropionic acid (PFPrA)	3.06	400	163.03	119.01
14.	Trifluoroacetic acid (TFA)	3.77	400	113.03	69.01

Column	Raptor Polar X (cat.# 9311A52)
Dimensions:	50 mm x 2.1 mm ID
Particle Size:	2.7 µm
Temp.:	40 °C
Standard/Sample
Diluent:	50:50 Water:methanol
Conc.:	400 ng/L
Inj. Vol.:	10 µL
Mobile Phase
A:	Water, 10 mM ammonium formate, 0.05% formic acid
B:	60:40 Acetonitrile:methanol, 0.05% formic acid
	Time (min) Flow (mL/min) %A %B 0.00 0.5 15 85 8.00 0.5 15 85

Detector	MS/MS
Ion Mode:	ESI-
Mode:	MRM
Instrument	UHPLC

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Passivare o non passivare?

Rilevare il glifosato in tracce è difficile perché questo composto chela con i metalli attivi nel sistema LC. Anche se la colonna Raptor Polar X è trattata e arriva in laboratorio pronta per il primo utilizzo, potrebbe essere utile passivare i componenti metallici presenti lungo il percorso del campione nella strumentazione LC. La necessità o meno della passivazione dipende dall’applicazione e dal set-up specifico della strumentazione. Per l’analisi dei composti polari con capacità di chelazione nota (come il glifosato), Restek consiglia di trattare il sistema con una soluzione passivante per LC (cat.# 32475) prima di eseguire le analisi dei campioni.

La qualità Raptor resiste alle prove del tempo e dà vita a una nuova fase stazionaria

La colonna Raptor Polar X è stata progettata, realizzata e testata per rispettare gli stessi rigorosi standard che rendono le colonne Raptor sinonimo di qualità. Puoi sempre contare sul marchio di qualità Raptor: avrai prestazioni stabili un’iniezione dopo l’altra nell’analisi di campioni reali in matrici complesse come gli spinaci (Figura 8), e manterrai la stessa affidabilità colonna dopo colonna, quando dovrai sostituirla (Figura 9). Inoltre, l’adozione di un singolo ligando per la ritenzione ibrida della colonna Raptor Polar X garantisce che ogni colonna sia realizzata in modo uniforme e sia in grado di sopportare anche condizioni aggressive, come le iniezioni di grandi volumi d’acqua, senza alcuna perdita di fase stazionaria.

	Peaks	Conc. (ng/mL)	Precursor Ion	Product Ion 1	Product Ion 2	Product Ion 3
1.	AMPA	100	110.10	79.05	63.10	81.10
2.	Glufosinate	100	180.20	85.15	95.10	-
3.	Glyphosate	100	168.10	63.05	79.05	-

Column	Raptor Polar X (cat.# 9311A32)
Dimensions:	30 mm x 2.1 mm ID
Particle Size:	2.7 µm
Pore Size:	90 Å
Guard Column:	Raptor Polar X guard column cartridge 5 mm, 2.1 mm ID, 2.7 µm (cat.# 9311A0252)
Temp.:	35 °C
Standard/Sample	Spinach extract
Inj. Vol.:	2 µL
Mobile Phase
A:	Water, 0.5% formic acid
B:	Acetonitrile, 0.5% formic acid
	Time (min) Flow (mL/min) %A %B 0.00 0.5 35 65 5.0 0.5 90 10 6.5 0.5 90 10 6.51 0.5 35 65 8 0.5 35 65

Detector	MS/MS
Ion Mode:	ESI-
Mode:	MRM
Instrument	UHPLC
Sample Preparation	Frozen spinach was added to a Blixer processor with dry ice (3:1-4:1 ratio) and then ground into a very fine powder. The homogenate was placed into the freezer immediately. A 5.0 gram sample of the spinach powder was weighed into a 50 mL centrifuge tube (cat.# 25846). According to the QuPPe method (Quick Polar Pesticides Method), 5.0 mL of methanol with 1.0% formic acid was added into the centrifuge tube. The tube was shaken by hand for 1 min and then by a mechanical shaker vigorously for 5 min. After centrifuging for 10 min at 4200 rpm, the supernatant was filtered through a 0.22 μm filter (cat.# 23984). The final extract was fortified with the AMPA, glufosinate, and glyphosate at a final concentration of 100 ng/mL.

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	Peaks	Conc. (ng/mL)	Precursor Ion	Product Ion 1	Product Ion 2	Product Ion 3
1.	AMPA	100	110.10	79.05	63.10	81.10
2.	Glufosinate	100	180.20	85.15	95.10	-
3.	Glyphosate	100	168.10	63.05	79.05	-

Column	Raptor Polar X (cat.# 9311A32)
Dimensions:	30 mm x 2.1 mm ID
Particle Size:	2.7 µm
Pore Size:	90 Å
Temp.:	35 °C
Standard/Sample
Diluent:	Water
Inj. Vol.:	5 µL
Mobile Phase
A:	Water, 0.5% formic acid
B:	Acetonitrile, 0.5% formic acid
	Time (min) Flow (mL/min) %A %B 0.00 0.5 35 65 5.0 0.5 90 10 6.5 0.5 90 10 6.51 0.5 35 65 8 0.5 35 65

Detector	MS/MS
Ion Mode:	ESI-
Mode:	MRM
Instrument	UHPLC

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Colonne Raptor Polar X: rivoluziona l’analisi LC dei composti polari

Scarsa ritenzione, bassa risposta e procedure di preparazione dei campioni complesse... l’analisi dei composti polari pone da sempre delle difficoltà per quanto riguarda la qualità dei dati e la produttività del laboratorio. Ora la colonna Raptor Polar X, con l’innovativa fase che unisce la ritenzione HILIC e quella a scambio ionico in un unico ligando, semplifica notevolmente l’analisi di questi composti difficili e variegati. Inoltre, attraverso il legame di quell’unico ligando alle particelle superficialmente porose (SPP), Restek ha creato una fase che trattiene e separa efficientemente una vasta gamma di composti polari. La sinergia creata da queste caratteristiche dà origine a una capacità senza precedenti di analizzare una vasta gamma di composti polari, fornendo agli scienziati che eseguono analisi LC in svariati settori uno strumento potente, performante e versatile.

Bibliografia

1. M. Anastassiades, A.-K. Wachtler, D. I. Kolberg, E. Eichhorn, H. Marks, A. Benkenstein, S. Zechmann; D. Mack, C. Wildgrube, A. Barth, I. Sigalov, S. Görlich, D. Dörk, G. Cerchia, Quick method for the analysis of highly polar pesticides in food involving extraction with acidified methanol and LC - or ICMS/MS Measurement - I. Food of Plant Origin (QuPPe-PO-Method)–Version 12 (published on EURL-SRM website on July 23, 2021). https://www.eurl-pesticides.eu/docs/public/tmplt_article.asp?LabID=200&CntID=1115&Theme_ID=1&Pdf=False&Lang=EN