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Schnelle Direktanalyse underivatisierter Aminosäuren in Säuglingsanfangsnahrung

Vorgestellte Applikation: Underivatisierte Aminosäuren auf Raptor Polar X

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  • Einfache One-Step-Probenvorbereitung für die Direktanalyse underivatisierter Aminosäuren.
  • Gleichzeitige Analyse nichtpolarer, polarer, positiv geladener und negativ geladener Aminosäuren in einem kurzen 10-minütigen Lauf.
  • Sorgfältig entwickelter Gradient trennt Kontaminanten von den Zielanalyten. 

Um sicherzustellen, dass der Nährstoffbedarf erfüllt wird, werden zuverlässige Analysemethoden für die genaue Bestimmung freier Aminosäuren in Säuglingsanfangsnahrung benötigt. Ein typischer Ansatz ist eine Vorsäulenderivatisierung gefolgt von einer Reversed-Phase-LC-Analyse, wobei die Derivatisierung aufgrund der mangelnden Retention und schlechten Empfindlichkeit der freien Aminosäuren erforderlich ist. Diese Methoden sind jedoch oft zeitaufwendig und arbeitsintensiv. Die Verwendung von perfluorierten Säuren als Ionenpaarreagenzien zur Verbesserung der Retention von underivatisierten Aminosäuren auf einer C18-Säule ist eine weitere häufig verwendete Methode; dieses Verfahren kann sich aber negativ auf das chromatographische System und das Massenspektrometer auswirken. 

Beim hier vorgestellten einfacheren Verfahren können underivatisierte Aminosäuren im Anschluss an eine One-Step-Probenvorbereitung direkt bestimmt werden, wenn eine Raptor Polar X-Säule in Verbindung mit einem MS/MS-Detektor verwendet wird. Raptor Polar X-Säulen besitzen eine Hybrid-Phasenchemie (HILIC und Ionenaustausch), die das für die gleichzeitige Analyse einer Vielzahl von Analyten erforderliche ausgewogene Retentionsverhalten bereitstellt. Underivatisierte Aminosäuren mit nichtpolaren, polaren, positiv geladenen und negativ geladenen Seitenketten wurden ausreichend retardiert und dann mithilfe eines 10-minütigen Gradienten schnell eluiert. Dieser Gradient war außerdem in der Lage, Kontaminanten von den Zielanalyten zu trennen, was die Methode robuster macht. Zeitaufwendige und arbeitsintensive Verfahren zur Probenvorbereitung, die auch teure Derivatisierungskits einschließen können, lassen sich so durch eine einfache Proteinfällung und Direktanalyse des resultierenden Extrakts ersetzen. Die Direktanalyse underivatisierter Aminosäuren auf einer Raptor Polar X-Säule liefert ausgezeichnete Ergebnisse in einem schnellen einfachen Arbeitsablauf und ist damit eine vorteilhafte Alternative zu herkömmlichen Methoden.

cgarm-img
LC_FF0579
PeakstR (min)Precursor IonProduct Ion
1.Tryptophan1.17205.07146.08
2.Phenylalanine1.26166.13120.10
3.Leucine1.41132.1386.10
4.Isoleucine1.55132.1386.10
5.Methionine1.62150.07104.10
6.Tyrosine1.69182.10136.08
7.Taurine1.91126.07108.07
8.Valine1.98118.1372.11
9.Proline2.29116.1370.09
10.Alanine3.0090.0344.10
PeakstR (min)Precursor IonProduct Ion
11.Threonine3.12120.1374.08
12.Glycine3.6276.1030.11
13.Glutamine3.87147.1384.07
14.Serine3.93106.0760.09
15.Asparagine4.08133.1374.07
16.Arginine4.47175.1770.09
17.Histidine4.66156.07110.16
18.Lysine4.97147.1384.13
19.Glutamic acid5.89148.1084.10
20.Cystine6.10241.13152.00
21.Aspartic acid7.12134.0774.06
ColumnRaptor Polar X (cat.# 9311A12)
Dimensions:100 mm x 2.1 mm ID
Particle Size:2.7 µm
Temp.:30 °C
Standard/Sample
Diluent:20:80 Water:acetonitrile, 0.01 N HCl
Conc.: Endogenous amino acids
Inj. Vol.:5 µL
Mobile Phase
A:Water, 0.5% formic acid
B:Mobile Phase B: 9:1 Acetonitrile:20 mM ammonium formate in water (pH 3.0) (The ammonium formate concentration is 20 mM relative to the total volume of mobile phase B. See preparation notes for instructions on diluting a 200 mM aqueous starting solution.)
Time (min)Flow (mL/min)%A%B
0.000.51288
3.500.51288
8.000.57030
8.010.51288
10.00.51288
DetectorMS/MS
Ion Mode:ESI+
Mode:MRM
InstrumentUHPLC
Sample PreparationA 200 µL aliquot of protein hydrolysate formula (Similac ALIMENTUM) was mixed with 800 µL of acetonitrile and 10 µL of 1 N HCl. After centrifugation at 4000 rpm for 5 minutes, the supernatant was diluted 20-fold with 20:80 water:acetonitrile (0.01 N HCl) and injected for analysis.
NotesMobile Phase B Preparation: To make 500 mL of mobile phase B, measure ~45 mL of water into a small beaker and add 1 mL of 10 M ammonium formate solution. Adjust pH to 3.0 by adding formic acid and then bring the volume to 50 mL with water. Combine this 50 mL ammonium formate solution (pH 3.0) with 450 mL of acetonitrile to complete the preparation.
FFFA3436A-DE