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Breite Peaks in der LC durch zu hohes Systemvolumen

7 Dec 2023

Möchte man die LC-Analytik beschleunigen oder Lösemittel sparen, kann man dies unter anderem durch folgende Änderungen bei der Säule machen:

  • Einen kleineren Innendurchmesser wählen.
    • Lösemittel-Ersparnis durch geringere Flussrate.
  • Eine kürzere Säule mit kleineren Partikeln nehmen. (Der ID wird dabei meist auch reduziert.)
    • Bessere Trennleistung, deshalb reicht meist die kürzere Säule.
    • Schnellere Flussrate möglich, Beschleunigung der Analytik.
  • Eine Core-Shell Säule nehmen.
    • Schärfere Peaks, bessere Trennleistung ohne Verringerung der Partikelgröße.
    • Schnellere Flussrate möglich, Beschleunigung der Analytik.

In den Fällen, in denen sich dabei das Volumen der Säule verringert, wird irgendwann das Systemvolumen wichtig (alles, was sich zwischen Injektor und Säule befindet).

  • Vielleicht hat der Ein oder Andere ja schon erlebt, dass die erhoffte Verbesserung der Peakschärfe und Trennleistung am älteren HPLC-Gerät ausgeblieben ist und die Peaks wider Erwarten breit (geblieben) sind?
  • Dann könnte das am System(tot)volumen gelegen haben. Hier ein Beispiel, welchen Unterschied im Chromatogramm eine Veränderung des Systemvolumens vor der Säule verursachen kann:

Breite Peaks in der LC durch zu hohes Systemvolumen

Dies zeigt ...

  • dass bei der Verringerung des Säulenvolumens (grobe Faustregel: < 100 mm Länge, < 3 mm Innendurchmesser) das Totvolumen der Anlage vor der Säule eine Rolle spielen und Peaks breiter werden lassen kann als erwartet.
    • Der Effekt ist hauptsächlich bei isokratischer Arbeitsweise zu sehen, mit Gradientelution kann man einiges ausgleichen. Allerdings sind früh eluierende Substanzen auch dort anfällig für Peakverbreiterung.
  • Es kann passieren, dass man mit einer älteren Anlage, die noch nicht totvolumenoptimiert ist, gar nicht alle Vorteile einer modernen, kurzen, dünnen Säule mit kleinen Partikeln ausnutzen kann.
    • Hier kann man sich aber mit 5μm Core-Shell Säulen helfen, z.B. mit 3 mm ID und 100-150mm Länge. Durch den speziellen Aufbau der Partikel erreicht man damit immerhin Trennleistungen wie mit einer vollporösen 3μm Säule. Das ist meist schon eine sehr gute Verbesserung für die älteren Geräte (siehe Flyer Raptor 5μm).

Dies zeigt aber auch ...

  • dass man beim Installieren von Kapillaren zwischen Injektor und Säule vorsichtig sein sollte. Erwischt man aus Versehen eine Kapillare mit zu dickem Innendurchmesser, kann dies eine Peakverbreiterung zur Folge haben. Im obigen Beispiel der Simulation des „worst case“ wurde das höhere Systemvolumen nämlich einfach durch Einbau eines zusätzlichen Stückes Kapillare erreicht.
    • 22 μL zusätzliches Systemvolumen erreicht man z.B. durch Einbau von ca. 10 cm Tubing mit einem Innendurchmesser von 0.5 mm (0.02") oder ca. 40 cm Tubing mit einem ID von 0.25 mm (0.01").
    • Der Innendurchmesser einer Kapillare hat einen stärkeren Einfluss auf deren Volumen, da der Radius im Quadrat ins Volumen eingeht, die Länge nur einfach (V = p r² L). D.h. die Verdopplung der Länge einer Kapillare verdoppelt deren Volumen, die Verdopplung des Innendurchmesser vervierfacht es.
  • Also sollte man den Innendurchmesser der Verbindungskapillaren möglichst klein halten, aber auch nicht ZU klein, es muss für die jeweilige Anlage und Arbeitsweise noch praktikabel sein.
    • Je dünner die Verbindungskapillaren sind, desto leichter verstopfen sie und desto mehr Rückdruck verursachen sie auch.
      • Wer erfolgreich an einem UHPLC-Gerät arbeitet, ist dünne Kapillaren und hohe Drücke gewohnt, aber an einer klassischen HPLC-Anlage mit langen Säulen mit 5μm Partikeln und 4.6 mm ID muss man im Normalfall einfach nicht so sauber bzw. partikelfrei arbeiten wie in der UHPLC. Dann kann es durchaus auch mal Probleme mit verstopften Kapillaren und zu hohem Druck geben.
      • Am häufigsten werden in der LC Verbindungskapillaren mit ID 0.13 mm (0.005“) oder 0.18 mm (0.007“) verwendet, gefolgt (mit deutlichem Abstand) von 0.25 mm (0.01“).