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Schwankende Retentionszeiten in der LC durch ungenügende Äquilibrierung

13 Dec 2023

Wenn Retentionszeiten in der LC schwanken, d.h. nicht stabil sind, kann das unterschiedliche Ursachen haben wie beispielsweise Unregelmäßigkeiten in der Flussrate oder der Gradientenmischung, Temperaturschwankungen, falsch angesetzte Eluenten, usw.

Es kann aber auch an der Methode liegen, hauptsächlich an der Äquilibrierungszeit im Gradienten.

  • Früh eluierende Substanzen sind meist stärker betroffen als solche, die erst spät im Gradienten eluieren.
  • Bei isokratischem Arbeiten tritt das Problem naturgemäß nur bei den ersten Läufen auf.

Die Retention ergibt sich durch Wechselwirkungen der Analyten mit der stationären Phase. Diese finden im INNEREN der Partikel des Säulenmaterials statt. D.h. alle Partikel müssen zunächst vollständig mit dem Eluenten gefüllt und die ganze INNERE Oberfläche damit benetzt werden. Das dauert aber seine Zeit, da die Bewegung im Inneren der Partikel ausschließlich über (die relativ langsamen) Diffusionsprozesse erfolgt.

Wie lange die Äquilibrierungsphase dauert, lässt sich nicht allgemein beantworten.

  • Das Säulentotvolumen ist sicherlich eine wichtige Größe.
    • Ca. 10 Säulentotvolumina sind eine ganz gute Faustregel zum Äquilibrieren.
    • Exakt berechnen lässt sich das Säulentotvolumen übrigens aus der Totzeit und der Flussrate.
    • Hier zur Orientierung ungefähre Werte für das Säulentotvolumen gängiger Säulendimensionen.
Säulendimensionen Säulen(tot)volumen ungefähr
 
2.0 x 50 mm 0,12 mL
2.0 x 100 mm 0,24 mL
2.0 x 150 mm 0,35 mL
 
3.0 x 50 mm 0,26 mL
3.0 x 100 mm 0,53 mL
3.0 x 150 mm 0,79 mL
3.0 x 250 mm 1,32 mL
 
4.6 x 50 mm 0,62 mL
4.6 x 100 mm 1,25 mL
4.6 x 150 mm 1,87 mL
4.6 x 250 mm 3,11 mL

 

  • Das Totvolumen der Anlage spielt natürlich auch eine Rolle.
  • Es können allerdings auch weniger Säulenvolumina notwendig sein zur Äquilibrierung, aber auch bedeutend mehr, denn sie ist auch abhängig vom jeweiligen Mechanismus und dessen Kinetik.
    • RP-Wechselwirkungen sind recht schnell, ionische Wechselwirkungen dagegen langsam.
    • Im Spezialfall der HILIC-Chromatografie muss sich zunächst eine stabile wässrige Schicht auf der polaren stationären Phase ausbilden, was ziemlich lange dauern kann.

„Äquilibrieren“ heißt nicht umsonst „ins Gleichgewicht bringen“ (Quelle: Duden Online). Also kann eine stabile Retentionszeit der Analyten erst dann erreicht werden, wenn die stationäre Phase komplett mit dem Starteluenten gefüllt und benetzt ist und stationäre Phase und Eluent sich im Gleichgewicht befinden.

Sollten Sie Probleme mit schwankenden Retentionszeiten im Gradienten haben:

  • Verlängern Sie einfach die Äquilibrierungszeit mit dem Starteluenten und machen Sie eine Reihe von Injektionen, um zu sehen, ob es einen Effekt hat.
  • Spülen Sie die Säule auch mal gründlich mit hohem Gehalt an starkem Eluenten für die jeweilige Methode (z.B. 95% Methanol oder Acetonitril bei RP-Mechanismus).
    • Das schadet nie und behebt Probleme, die durch die Ansammlung von Matrixbestandteilen auf der Säule entstehen, z.B. durch zu geringe Spülzeit am Ende des Gradienten.
    • Dauerhafte Kontamination auf der Säule zeigt sich zwar durch kontinuierlich abnehmende Retentionszeiten, aber es könnte auch der Fall auftreten, dass ein Teil des Schmutzes sich im Lauf der Zeit wieder ablöst. Dann würden die Retentionszeiten kurzzeitig wieder länger werden.