Développement de Méthodes ILSP (In-Line Sample Preparation)

La préparation d’échantillons en ligne ILSP est destinée à remplacer les procédures manuelles chronophages telles que les méthodes QuEChERS ou SPE, en permettant une purification automatisée des échantillons. Une fois installée sur un instrument configuré pour des applications LC bidimensionnelles, une cartouche Restek Revive ISLP va retenir les composés interférents provenant de la matrice. Ces composés sont ensuite éliminés par un rinçage ("backflush") de la cartouche à l’aide d’un solvant de rinçage. Le rinçage a lieu pendant l’analyse LC-MS/MS afin que la cartouche soit prête à purifier un nouvel échantillon avant la prochaine injection, faisant de la procédure ILSP une procédure très efficace pouvant augmenter considérablement le nombre d’échantillons analysés et le débit d’analyses. La purification Revive ILSP est très efficace et peut être associée à une simple extraction solide-liquide afin d’économiser du temps et de l’argent. Cet article décrit en détails comment développer des méthodes ILSP pour que les laboratoires puissent profiter des avantages de cette technique très puissante.

Configuration instrumentale requise

Pour pouvoir utiliser l’approche ILSP, vous aurez besoin d’une chaîne HPLC usuelle, équipée d’une pompe binaire ou quaternaire, d’un passeur d’échantillons capable de faire des lavages internes de l’aiguille, d’un compartiment colonne et d’un détecteur. Comme le montre la Figure 1, pour être compatible, un instrument doit également inclure :

• Une pompe isocratique indépendante qui servira à rincer la cartouche ILSP avec le solvant de rinçage.
• Une vanne de "switch" haute-pression à 6 voies qui contrôlera le débit allant vers la cartouche ILSP pendant l’étape de rinçage.

N’hésitez pas à contacter votre fournisseur d’instruments LC si vous avez besoin d’aide pour configurer votre instrument.

Développement de méthodes

Comme pour toute autre technique de préparation d’échantillons, il est nécessaire d’évaluer les conditions ILSP pour chaque nouvelle liste d’analytes et/ou pour chaque nouvelle matrice. Utilisez l’approche suivante d'"analyte pass-through" pour le développement de votre méthode de préparation d’échantillons en ligne afin de déterminer les conditions optimales de la méthode ILSP, spécifiques à vos échantillons et matrices.

Dans cette approche "analyte pass-trough", une cartouche Revive ILSP est utilisée pour éluer les analytes d’intérêt tout en retenant les composés interférents provenant de la matrice. Une fois que les analytes d’intérêt sont passés à travers la cartouche ILSP pour ensuite être séparés dans la colonne analytique, la vanne de "switch" haute-pression à 6 voies change de position, et les composés de la matrice qui étaient retenus sur la cartouche ILSP sont alors envoyés vers la poubelle à l’aide du solvant de rinçage (par la pompe indépendante). Les étapes suivantes permettent de définir les temps de "switch" de la vanne et les conditions du solvant de rinçage appropriés pour une méthode donnée.

NOTE : il est supposé ici qu’une méthode chromatographique appropriée à la matrice et aux analytes d’intérêt a déjà été développée. Si la méthode analytique n’existe pas, la séparation analytique doit être établie avant de développer la méthode ILSP.

Étape 1 : Chargement de la colonne – Détermination de la rétention des analytes sur la cartouche ILSP

Cette étape a pour objectif de contrôler le temps nécessaire aux analytes d’intérêt pour éluer de la cartouche Revive ILSP, ce qui va déterminer le temps alloué à un échantillon pour passer à travers la cartouche ILSP et être chargé sur la colonne analytique avant le premier évènement de "switch" de la vanne.

• Configurer la vanne de "switch" 6 voies comme illustré dans la Figure 2 avec une union à la place de la colonne analytique.
• Injecter un standard en solvant (sans matrice) contenant les analytes d’intérêt sur la cartouche ILSP en utilisant les phases mobiles et les conditions de gradient de la méthode analytique existante. Ne pas oublier d’ajuster les fenêtres MRM si nécessaire.
• Localiser sur le chromatogramme l’analyte d’intérêt éluant en dernier. Le temps auquel cet analyte est complètement élué définit alors le temps le plus précoce auquel la vanne peut être programmée pour passer de la position de chargement de la colonne analytique à la position de rinçage de la cartouche ILSP (décrite dans la Figure 3). Pour tenir compte des possibles légères variations de la rétention de la colonne d’un lot à l’autre, ajouter 10 à 20 secondes à ce temps déterminé pour éluer complètement le dernier analyte d’intérêt.

Étape 2 : Rinçage de la cartouche ILSP – Détermination de la composition et des conditions du solvant de rinçage

La deuxième étape du développement d’une méthode ILSP consiste à déterminer la composition la plus appropriée du solvant de rinçage ainsi que le débit optimum et la synchronisation de la vanne. Cela permet de s’assurer que les composés interférents provenant de la matrice retenus lors d’une injection sont bien éliminés de la cartouche Revive ILSP avant l’injection suivante.

• Préparer un solvant de rinçage initial composé de formiate d’ammonium 2 mM et 0.1 % d’acide formique dans le méthanol. Cette composition conviendra à de nombreuses applications, mais comme indiqué ci-dessous, d’autres solvants et compositions peuvent être évalués en fonction des résultats initiaux.

• Pour plus de facilité, remplacer la phase mobile B par le solvant de rinçage choisi (Figure 3).

• Utiliser un débit de 1 ml/min et injecter sur la cartouche ISLP un blanc de matrice (sans analytes d’intérêt présents).

• Suivre la présence de la matrice en mode "full scan", ou en mode SIM si des ions spécifiques à la matrice sont connus.

• Noter le temps nécessaire pour que le chromatogramme TIC retourne à la ligne de base, ce qui indique que la matrice a été complètement éliminée de la cartouche ILSP.

• Ce temps est le temps nécessaire pour éliminer complètement de la cartouche ILSP les composés interférents provenant de la matrice qui étaient retenus, et ce temps doit être comparé au temps de cycle total de la méthode analytique.

  • Si la matrice est complètement éliminée de la cartouche ILSP avant la fin de l’analyse chromatographique (Figure 4), la méthode de rinçage n’a probablement pas besoin d’une optimisation supplémentaire et peut donc être programmée dans la méthode globale, en utilisant une deuxième pompe indépendante pour contrôler le débit du solvant de rinçage (Pompe C) appliqué sur la cartouche ILSP.

  • Si le temps nécessaire à l’élimination complète de la matrice de la cartouche ILSP est plus long que le temps de cycle de la méthode analytique, alors la composition du solvant de rinçage et/ou le débit doivent être optimisés pour améliorer l’efficacité du rinçage.

    • Pour de meilleures performances, il est recommandé de maintenir les concentrations de tampon entre 2 et 10 mM et les concentrations d’acide entre 0.1 et 0.5 %. Des précautions doivent également être prises pour éviter la précipitation du tampon lors de la rééquilibration de la cartouche ILSP dans les conditions initiales de phase mobile.

NOTE : Ne pas tamponner le solvant de rinçage en dehors de la plage de pH 2–8.

Étape 3 : Mises à jour de la méthode – Ajout des évènements ILSP à une méthode analytique existante

Cette dernière étape a pour but d'utiliser les informations recueillies lors des étapes 1 et 2 pour ajouter ces évènements à la méthode analytique existante aux temps appropriés. La Figure 4 montre un exemple des endroits où de nouveaux événements seraient ajoutés dans une méthode HPLC en gradient typique. Un exemple de développement d’une méthode ILSP pour une méthode existante d’analyse de pesticides dans les aliments est présenté dans le Tableau I.

Tableau I : Exemple de développement d’une méthode Revive ILSP pour une méthode d’analyse de pesticides dans les aliments

Tableau des évènements chromatographiques originaux :
Temps (min)	% Phase Mobile B
0	5
2	60
4	75
6	100
7	100
7.01	5
9	Stop
Valeurs déterminées lors du développement de la méthode ILSP :
Etape 1 :
Temps pour éluer le dernier analyte d’intérêt hors de la cartouche ILSP = 4.6 min
Temps "tampon" ajouté pour s’assurer du transfert complet du dernier analyte d’intérêt = 0.3 min
Temps de "switch" de la vanne en position de rinçage ILSP (somme des temps précédents) = 4.9 min
Etape 2 :
Composition du solvant de rinçage = formiate d’ammonium 2 mM & 0.1% d’acide formique dans le méthanol
Débit du solvant de rinçage = 1 ml/min
Temps pour éliminer de la cartouche ILSP les composés interférents provenant de la matrice = 0.6 min
Temps “tampon” pour tenir compte des variations de gravité des composés de la matrice retenus = 0.4 min
Temps total pour rincer la cartouche ILSP = 1.0 min
Remarque : Aucune modification du débit et de la composition du solvant de rinçage n’est nécessaire.
Tableau des évènements chromatographiques mis à jour :
Temps (min)	% Phase Mobile B	Événement
0	5
2	60
4	75
4.9	-	"Switch" de la vanne en position de rinçage ILSP (voir Figure 4).
4.92	-	Définir du débit du solvant de rinçage ILSP à 1 ml/min (pompe C).
5.92	-	Stopper le débit du solvant de rinçage pour économiser ce dernier (pompe C).
6	100
7	100	Tous les composés ont été élués de la colonne analytique à ce stade.
7.01	5	Retour aux conditions initiales de phase mobile pour rééquilibrer la colonne.
7.05	-	“Switch” de la vanne en position de chargement de la colonne analytique pour permettre à la cartouche ILSP de se rééquilibrer.*
9	Stop

*Il est recommandé d’attendre jusqu’à ce point pour le "switch" de la vanne afin d’éviter toute perturbation possible de la ligne de base (due à ce "switch" de la vanne) pendant la séparation analytique.

Maintenance et "troubleshooting"

La plupart des problèmes rencontrés avec la préparation d’échantillons en ligne peuvent être évités ou rectifiés avec des connaissances et informations de base sur la matrice et la méthode. Dans un premier temps, les ions spécifiques à la matrice doivent être identifiés en comparant les données de "scan" d’un blanc de matrice extrait et d’un blanc de solvant d’extraction. Une fois que les ions spécifiques à la matrice ont été déterminés, ils peuvent être entrés dans la méthode analytique et suivis en mode SIM. Cette étape fournit un outil de diagnostic précieux qui peut être utilisé lorsque l’on rencontre des problèmes de performances pour déterminer si ceux-ci sont liés à la présence de contaminants persistants provenant de la matrice. Des solutions aux problèmes les plus couramment rencontrés sont présentées dans le Tableau II.

En utilisant cette approche pour le développement d’une méthode ILSP et en sachant comment résoudre les problèmes pouvant survenir, les laboratoires peuvent inclure l’ILSP à leurs méthodes existantes en toute confiance et augmenter considérablement leur nombre d’échantillons analysés.

Tableau II : Solutions pour le “Troubleshooting” ILSP

Problème	Cause possible	Solution
Les pics éluant en dernier sont manquants	Le temps défini pour l’évènement de chargement de la colonne est incorrect	Augmenter le temps nécessaire au chargement de la colonne
Certains pics sont absents	Fenêtres MRM mal définies	L’ajout de la cartouche ILSP peut entraîner une légère modification des temps de rétention nécessitant la mise à jour des fenêtres MRM
Pics larges/déformés pour les composés éluant en premier	Solvant de rinçage de l’aiguille inapproprié	Si vous utilisez un solvant fort pour le rinçage interne de l’aiguille, veillez à rincer ensuite avec un solvant faible (de composition égale aux conditions initiales de phase mobile) pour éviter l’élargissement de la bande chromatographique.
	Solvant d’injection (de l’échantillon) inapproprié	Réduire le volume d’injection pour les échantillons dissous principalement dans l’acétonitrile ou le méthanol pour éviter l’élargissement de la bande chromatographique
Pic déformé/Perturbation de la ligne de base	Le rinçage interne de l’aiguille peut causer des perturbations de la ligne de base qui peuvent impacter la forme du pic	Lancer le rinçage interne de l’aiguille une fois que tous les analytes ont été élués de la colonne analytique
Rendement faible	Contamination du passeur d’échantillons par la matrice	Optimiser le rinçage interne de l’aiguille avec un solvant dans lequel la matrice est soluble
	Rinçage de la cartouche ILSP insuffisant	Optimiser le solvant de rinçage ILSP pour complètement éliminer les composés interférents provenant de la matrice
Pics de matrice dans les injections de blancs de solvant	Contamination du passeur d’échantillons par la matrice	Optimiser le rinçage interne de l’aiguille avec un solvant dans lequel la matrice est soluble
	Rinçage de la cartouche ILSP insuffisant	Optimiser le solvant de rinçage ILSP pour complètement éliminer les composés interférents provenant de la matrice