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Séparation améliorée de l’indéno(1,2,3-c,d)pyrène et du dibenz[a,h]anthracène sur la nouvelle colonne Rxi-SVOCms

24 Aug 2022

Lors du développement de la colonne Rxi-SVOCms, notre objectif était d’optimiser la résolution des HAP isobares tout en visant un temps de rétention de 16 minutes pour le benzo[ghi]pérylène (BghiP) sur une colonne de 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm en utilisant nos paramètres d’acquisition des COSV en injection "split" [GC_EV1604]. La séparation benzo[b]fluoranthene - benzo[k]fluoranthene (BbF - BkF) est celle qui demande le plus d'attention, mais nous avons également consacré de nombreuses ressources pour optimiser celle de l’indéno[123-cd]pyrène et le dibenz[ah]anthracène (IcdP - DahA) dans le temps imparti.

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Figure 1 - Chromatogramme des ions caractéristiques (m/z) d’indéno[123-cd]pyrène (à gauche), montrant une bonne séparation des interférences de dibenz[ah]anthracène (à droite). Les sommets représentent les aires de pics pour le [276+].

Pourquoi ces deux HAP dont les masses molaires sont différentes doivent être séparés par la chromatographie ? Parce que le DahA (masse molaire = 278 g/mol) génère un signal très fort à m/z = 276 (la masse molaire de l’IcdP) sous une ionisation électronique à 70eV. La coélution de ces deux composés entraîne plusieurs problèmes lors de l’analyse :

  • Biais d'étalonnage
  • Mauvaise caractérisation de la toxicité de l’échantillon
  • Identification erronée du signal de DahA [276+] comme celui de l'IcdP (particulièrement problématique pour les essais d’aptitude)
 

Biais d'étalonnage

La Figure 1 représente un chromatogramme des ions extraits (XIC ; Extracted ion Chromatogram) pour l’IcdP où l’IcdP et le DahA sont bien séparés avec la colonne Rxi-SVOCms (réf.16623). Si l’IcdP et le DahA coéluaient, le signal de l’ion quantitatif ([276+]) de l’IcdP augmenterait de 38,2 % du fait des ions de DahA. Un étalonnage réalisé dans ces conditions entraînerait un biais négatif important dans la concentration d’IcdP calculée dans un extrait d'échantillon.

Mauvaise caractérisation de la toxicité de l’échantillon

Le profil toxicologique d’un mélange de HAP se caractérise par des facteurs d’équivalence (PEF, Potency Equivalency Factor). La carcinogénicité est exprimée par rapport au composé de références "Benzo[a]pyrène (BaP)" :

  • Indéno[123-cd]pyrène PEF = 0.1
  • Dibenz[ah]anthracène PEF = 2.4
  • Benzo[b]fluoranthène PEF = 0.1
  • Benzo[k]fluoranthène PEF = 0.1
  • Benzo[a]pyrène PEF = 1.0
 

Le PEF de l’IcdP est de 0,1 seulement, tandis que celui du DahA est de 2,4. Donc, le fait de rapporter une concentration d’IcdP dans les échantillons avec un biais négatif de 40 % ne devrait pas être si grave, n’est-ce pas ? La réponse dépend vraiment de la quantité relative de chaque HAP dans les échantillons. La Figure 2 représente le résultat d’analyse du mélange de goudrons de houille de HAP, NIST SRM. Dans ce cas, la contamination par l’IcdP dépasse largement le DahA. S’il s’agissait d’un analyse des HAP dans une matrice alimentaire, un biais de 40 % en moins dans la valeur calculée pour un HAP associé à un signal fort pourra faire la différence entre un aliment caractérisé comme dangereux pour les êtres humains et un faux négatif permettant la distribution du produit.

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Figure 2 - Indéno[123-cd]pyrène et dibenz[ah]anthracène dans un mélange NIST SRM 1597a (extrait du GC_EV1606)

Erreur d’identification du signal ionique [276+] du dibenz[ah]anthracène

Cette situation est la plus simple, mais elle peut conduire à des résultats désastreux. Si l’IcdP et le DahA coéluent pendant l’analyse chromatographique, et qu’un échantillon issu d'un essai inter-laboratoire contient du DahA à une concentration modérément élevée, il est impossible d’identifier si l’ion [276+] provient du DahA ou de l’IcdP. Lors des essais inter-laboratoires d’aptitude (EILA), des erreurs consécutifs dans la quantification de ces composés peuvent conduire l’autorité de certification locale à retirer la certification qui autorise le laboratoire à effectuer ces analyses.

Conditions analytiques recommandées pour la colonne Rxi-SVOCms

La Figure 5 montre le niveau de contrôle CCV (Continuing Calibration Validation) (20 ng/µl) provenant de notre étalonnage en 8 points, avec des concentrations allant de 1 ng/µl à 120 ng/µl, ou de 100 pg à 12 ng pour chacun des 86 composés cibles et des étalons de substitution sur la colonne réf. 16623 – une colonne Rxi-SVOCms de 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm (GC_EV1604).

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Figure 3 - GC_EV1604 - Exemple de chromatogramme TIC (courant ionique total) pour une solution étalon de 94 composés semi-volatils avec une injection en mode "split-10:1" de 2 ng de chaque composé dans la colonne

La méthode est optimisée pour un temps d’analyse de 16 minutes, ce qui permet d’obtenir une excellente résolution des deux paires de HAP critiques. Vallée de 86% pour le BbF et le BkF conformément aux valeurs rapportées par MSD ChemStation et vallée de 87% pour l’IcdP et le DahA. Si ce temps d’analyse (16 mins) n’est pas suffisamment rapide, rendez-vous dans un prochain article. J’y explique comment gagner 5 minutes d’analyse sans impacter la séparation des HAP critiques.