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よくある質問 (FAQ): HPLC と UHPLC

  • 共有 :
  1. ピークがブロードにならない程度にLCカラムに注入できるサンプル量はどのくらいですか?
  2. カラムのサイズを変更する場合、注入量をどのくらい変更する必要がありますか?
  3. サンプル溶媒が移動相より溶出力が強い場合、どうなりますか?
  4. サンプルを移動相より溶出力が弱い注入溶媒(逆相での100%水など)で注入すると、よりシャープなピークを得ることができますか?
  5. 背圧の上昇やその他の詰まりや汚染の徴候にはどのように対処すればよいですか?
  6. LCの全カラム容量またはボイド容量はどのようにして決定しますか?
  7. 質量分析ではなく、UVでビフェニルカラムからブリードが見られるのはなぜですか?
  8. 爆発物(EPAメソッド8330Bに準拠)をHPLCで分析するには何を使用すればよいですか?

    Raptor LC カラム
  9. 新しいRaptor Biphenylカラムは、Restekの他のビフェニルカラムとどのように異なりますか?
  10. SPPシリカ基材のカラムは、具体的にはどのように、より高い効率および分離能を生み出しますか?
  11. 初めて使用する前やずっと使用していなかった場合、Biphenylカラムに特殊なコンディショニングが必要ですか?
  12. Raptor Biphenylカラムでのグラジエント分析に必要な平衡化時間はどのくらいですか?
  13. SPPカラムまたはRaptorカラムに適合する移動相溶媒は?
  14. Raptor Biphenylカラムの逆洗浄は可能ですか?
  15. Raptorカラムにどのくらい注入ができますか?
  16. Raptor ARC-18カラムは通常のC18とどのように異なりますか?
  17. RaptorARC-18カラムは、酸と塩基に対してどの程度うまく機能しますか?
  18. RaptorARC-18カラムは、100%水移動相で使用できますか?
  19. Raptorカラムが頑丈であることは、どのようにして知ることができますか?

    ガードカラム
  20. どのタイプのLCガードカラムシステムが必要ですか?
  21. UHPLCカラムに対応するResstekガードカートリッジはありますか?
  22. どのガードカートリッジを使用すればいいですか?
  23. Tridentガードシステムで使用するキャップフリットはどれですか。
  24. 別メーカーのカラムでRestekガードカートリッジを使用することはできますか?

    ハードウェア
  25. HPLCカラムのエンドフィッティングにはどのサイズのねじ山がありますか?
  26. 「10-32」とはどういう意味ですか?
  27. 10-32以外に、LCに使用されるねじ山のサイズはありますか?
  28. HPLC用ステンレススチールのフィッティングはポリマーベースのフィッティングとどのように異なりますか?
  29. UHPLCに使用できるフィッティングはどれですか?
  30. フィッティングを締めるにはどうすればよいですか?
  31. どのフィッティングをどのチューブに使用しますか?
  32. LCチューブの内径を知るにはどうすればよいですか?

    HILICメソッド
  33. HILICメソッドの問題を回避するにはどうすればよいですか?
  34. Raptor HILIC-Siカラムは、箱から出してすぐに使用できますか?
  35. 注入毎にRaptorHILIC-Siカラムを平衡化するには、どのくらいの時間を要しますか?
  36. HILICモードに使用する注入溶媒は?
  37. HILICモードでは、どのようなpHの影響に注意する必要がありますか?
  38. HILICモードに緩衝液を使用できますか? どんな種類?濃度は?

    PFASディレイカラムとは?
  39. PFASとは何ですか?
  40. GenXとPFBSとは何ですか?
  41. PFAS分析はどのようなラボで行われますか?
  42. 典型的なPFAS分析濃度はどのくらいですか?
  43. 他のLC-MS/MS分析と比較して、PFAS分析は何が異なりますか?
  44. LCシステムにPFASの汚染があるかどうかは、どうすればわかりますか?
  45. システム由来のPFASをサンプルと分離することが重要なのはなぜですか?
  46. PFASディレイカラムはどのように役立ちますか?

質問がリストに表示されていない場合、HPLCとUHPLCシステムのトラブルシューティングと分析についてはRestekのテクニカルサービスへお問い合わせください。 (お客様のご所属先とメールアドレスを入力ください。)

1. ピークがブロードにならない程度にLCカラムに注入できるサンプル量はどのくらいですか?

最適な流量と同様に注入量はカラムのサイズによって制限されます。理想的には、サンプルが移動相と同じ溶媒中にある場合、おおよその容量は以下のようになります:

カラム ID 容量 (µL)
2.1 mm (30 -100 mm length) 1-3
3.0-3.2 mm (50-150 mm length) 2-12
4.6 mm (50-250 mm length) 8-40

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2. カラムのサイズを変更する場合、注入量をどのくらい変更する必要がありますか?

最適な注入量は、カラムのシリンダー容積に直接関連しおり、従って、カラムの断面積(A=π r2)および長さ(L)に依存します。 そのため、注入量について既存のメソッドから調整を見積ることができます。

別の内径(充填剤と長さは同じまま)に変換する場合は、現在の体積に半径の2乗の比率を掛けて、新しいメソッドの正しい容量を決定します。例えば、現在150x4.6mmカラムに20μLを注入しているのであれば、150x3.0mmカラムに切り替える場合は、20 x (1.52)/(2.32)を掛けることで調整された容量を見積もることができます。新しい容量は約8.5μLになります。

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3. サンプル溶媒が移動相より溶出力が強い場合、どうなりますか?

通常、ピークの歪み、広がり、感度の低下、保持時間の減少をもたらすため、移動相より溶出力が強い溶媒で注入することはお勧めしません。このようなことは、一部の分析対象物が対称バンドで溶出するのではなく、カラム内を移動する速度が速すぎるために発生します。どうしても移動相よりも強い溶媒で注入する必要がある場合は、できるだけ容量を小さくし、溶媒が混和性であることを確認してください。 

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4. サンプルを移動相より溶出力が弱い注入溶媒(逆相での100%水など)で注入すると、よりシャープなピークを得ることができますか?

この場合、サンプルは最初はカラムの先端で濃縮され、タイトなバンドでカラムを移動します。この技術は、「on-column compression」または「point-injected」と呼ばれ、大量のサンプル注入によるバンドの広がりを最小限に抑えるために使用されることがあります(上記FAQ#8参照)。これが機能するためには、サンプル成分が移動相にも溶解する必要があることにご注意ください。

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5. 背圧の上昇やその他の詰まりや汚染の徴候にはどのように対処すればよいですか?

ブログ「Building up Pressure on HPLC?(HPLCで圧力が上がっている?)」の推奨事項に従ってください。 これは、圧力の原因を特定または確認するのに役立ちます。カラム自体が問題の原因であることが判明した場合は、LCカラムの洗浄に関する推奨事項のページに記載されているカラム再生手順に従ってください。将来の発生を回避するために、Restekは、フリットの詰まりおよびカラムの汚染の両方から逆相および順相分析LCカラムを保護するために、ガードカラムの使用を強く推奨します。

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6. LCの全カラム容量またはボイド容量はどのようにして決定しますか?

「カラムボリューム」という用語は、通常、ボイドボリュームを指し、シリカ粒子間にある移動相の容量を表します。 この領域は、粒子間空隙と呼ばれます。特定のカラムタイプの典型的な充填効率を推定する係数を、全カラム容量(π x 半径2 x 長さ)に掛けることによって、ボイドボリュームを推定することができます。全多孔性カラムの場合、ボイドボリューム(mL)の式は、V = (0.68) π r2 Lです。ここでは、V=カラムボリューム(mL)、r=カラム半径(cm)、L=カラム長(cm)です。Raptorカラムのような表面多孔質カラムでは、係数は異なり、式はV = (0.50) π r2 Lです。 

ボイドボリュームは、一般的に、その特定のカラム相に保持がないか、または無視できることが知られている分析対象物を含む標準を注入することによって実験的に推定されます。逆相HPLCの良い例はウラシルです。この推定値は、使用する特定の機器の余分なカラムデッドボリュームの影響も受けるため、わずかに異なる場合があることに注意してください。

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7. 質量分析ではなく、UVでビフェニルカラムからブリードが見られるのはなぜですか?

少量のブリードは、フェニル固定相を含むすべての固定相に固有であり、カラムのサイズと寸法に多少、依存します。このブリードは、通常は無視でき、保持時間には影響しませんが、特にUV検出によって目に見えることがあります。 多くの場合、コンディショニング後に減らすことができます。ブリードは、アイソクラティック溶出、勾配のより緩やかなグラジエントを使用すること、および/または分析ランの間にグラジエントフラッシュを組み込むことによって最小限に抑えることもできます。

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8. 爆発物(EPAメソッド8330Bに準拠)をHPLCで分析するには何を使用すればよいですか?

どのLCカラムも、これらの分析物を組み合わせてベースライン分離を提供することはできませんが、RestekのRaptor BiphenylおよびRaptor ARC-18カラムは、一次分析および確認分析のための優れた選択肢です。全多孔性HPLC粒子、すなわち、Ultra C8およびUltra Aromaxカラムも一つの選択肢です。さまざまなカラム固定相がこのメソッドの部分的なソリューションを提供する可能性があることに注意してください。しかし、Restekは、これらのペアが最適な結果を与えることを見出しました。

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Raptor LCカラム

9. 新しいRaptor Biphenylカラムは、Restekの他のビフェニルカラムとどのように異なりますか?

Raptor Biphenylは、表面多孔性シリカでできており、この粒子はよくSPPと略されます。SPPシリカは、多孔質の外層を有する固体のコアを持ち、HPLC粒子に典型的な直径(この場合は2.7 µm)で作られています。 SPPカラムは、より高い効率と分離能を有し、多くの場合は、全多孔質シリカを基材とするより小さいUHPLC粒子(1.9 µmなど)に近づきます。また、固体コア粒子を使用することには、いくつかのさらなる利点があります。SPPシリカ粒子は、カラムの分離能に大きな影響を与えることなく高流量で操作でき、UHPLCカラムのように高圧のシステムコンポーネントを必要としません。(通常のHPLCシステムでUHPLCのように見える分離を達成するのはよいことです!)

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10. SPPシリカ基材のカラムは、具体的にはどのように、より高い効率および分離能を生み出しますか?

効率の向上は、主に、粒子と移動相に出入りする溶質の移動相時間を短縮することで達成されますが、粒子サイズがより均一になることでも向上します。そして粒子サイズの均一さは、より一貫した充填を実現します。 より理論的な観点から、Van Deemterの式は、この現象を説明するための最良のアプローチです。 より良い効率は、ここではより小さいプレート高さ(H)として表されます。

Van Deemterの式は、カラムの流量とバンドの広がりと称されるピーク効率の関係を表します。

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SPPシリカのソリッドコアは、A項とB項(多流路拡散と軸方向拡散)の値を低くし、溶質の物質移動を改善し、物質移動のC項の値を低くします。したがって、理論段高Hを低くし、高流量でカラム効率を劇的に高めることができます。これは、UHPLC粒子にも当てはまりますが、通常の分析サイズのSPP粒子では、UHPLCの場合のように、カラム圧力が劇的に高くなることはありません。SPP粒子は、通常、粒子がより均一であり、より一貫性のある充填が得られ、全体的な効率も向上します。これらの要因すべてが、一般にSPPシリカカラムに関連付けられているバンドの広がりの明らかな低減をもたらします。

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11. 初めて使用する前やずっと使用していなかった場合、Biphenylカラムに特殊なコンディショニングが必要ですか?

多くの場合、Raptor Biphenylカラムは他の逆相カラムとまったく同じように動作します。しかしながら、特定の状況では、より長い平衡化時間が必要になる場合があります。アセトニトリルやメタノールなどの有機溶媒を切り替えるには、有機溶媒比率の高い移動相で15~20分間のフラッシュが必要な場合があります。

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12. Raptor Biphenylカラムでのグラジエント分析の間にどのくらいの平衡化時間が必要ですか?

全多孔性シリカまたはSPPシリカのどちらを使用しいている場合でも、グラジエントを使用している場合は、分析と分析の間である程度の平衡化時間が必要であり、時間は両方のタイプのカラムで同じです。通常、イオンペア法を使用していない限り、7カラム(ボイド)ボリュームに相当する量で十分です。

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13. SPPカラムまたはRaptorカラムに適合する移動相溶媒は?

水、メタノール、アセトニトリルなど、逆相LCに一般的に使用される溶媒はすべて問題なく機能します。

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14. Raptor Biphenylカラムの逆洗浄は可能ですか?

UHPLCカラムと同様に、これらのカラムのフローを逆にすることはお勧めしません。ただし、混和性があれば、一連の溶媒をポンプで通液することもできます。

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15. Raptorカラムにどのくらい注入ができますか?

注入量は、カラムサイズ、サンプル溶媒、および分析条件など、さまざまな要因によって異なります。クロマトグラフィーでは、一般的にですが、移動相と同じかまたは移動相よりも溶出力の弱い溶媒中でできるだけ少ない注入量を試みてください。

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16. Raptor ARC-18カラムは通常のC18とどのように異なりますか?

顕著な差は、結合された官能基の頑丈さです。ARC-18では、立体保護によって、残留シラノール基はシールドされ、また不活性になります。その結果、pH1.0~8.0のより広い使用範囲が得られます。ARC-18は、1.0~3.0のpHの間で特に有用であり、他のC18カラム相はこれらの過酷な条件下で分解し始めます。Raptor Biphenylカラムと同様に、固定相は表面多孔性シリカ粒子(SPP)に結合しています。SPPの利点については、以前の FAQをご覧ください。

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17. RaptorARC-18カラムは、酸と塩基に対してどの程度うまく機能しますか?

ARC-18は、荷電した塩基に対して保持を提供し、多くの場合、従来のエンドキャップされたC18よりも好ましいです。中性の酸の場合は、良好に機能し、特にpH<3でエンドキャップされたC18よりも推奨されます。ARC-18は、中性の塩基および荷電した塩基にも機能しますが、より低いpH範囲で、多くの利点を提供し、最高のパフォーマンスを発揮します。

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18. RaptorARC-18カラムは、100%水移動相で使用できますか?

いいえ。RaptorARC-18カラムは、移動相中に少なくとも5%の有機溶媒を含む移動相で使用することをお勧めします。より高い水分含量を必要とするアプリケーションについては、Ultra Aqueous C18またはPinnacle DB Aqueous C18をお勧めします。

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19. Raptorカラムが頑丈であることは、どのようにして知ることができますか?

サンプルマトリックスによる目詰まりがしにくいフリットを使用しており、カラム充填は起こりうる高圧による損傷を受けにくくなっています。さらにカラムの寿命を延ばすために、ガードカラムによる追加の保護も利用可能であり、推奨されます。www.restek.com/raptor へアクセスすると、ご使用中のカラムと他社と比較試験しているのをご覧いただけます。しかし、最終的証明には、お客さまご自身でお試しいただくことがお勧めです。 

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ガードカラム

20. どのタイプのLCガードカラムシステムが必要ですか?

ガードカラムシステムはホルダーとカートリッジで構成されており、使用している技術と分析カラムによって正しい選択肢が決定されます。Restekは、EXP、Roc、Trident(ダイレクトおよびインライン)の3つのガードカラムシステムを提供しています。これらはそれぞれ、LCカラムファミリーの1つに一致するように設計されており、特定の技術を対象としています。

EXPホルダーとカートリッジ
  • ホルダーは、UHPLCに至るまですべてのHPLCとカートリッジに互換性があります(20,000psi[1400+bar]まで)。
  • RaptorおよびForce LCカラムで使用するよう設計されています。
 
Rocホルダーとカートリッジ
  • 従来のHPLC機器と互換性があります。
  • Roc HPLCカラムで使用するために設計されています。
 
Tridentダイレクトホルダーとカートリッジ
  • 従来のHPLC機器と互換性があります。
  • レガシーHPLCカラム(Ultra、Pinnacle II、Pinnacle DB、Allure、Viva)で使用するよう設計されています。
  • 3つの保護レベルで使用できます。
 
Tridentインラインホルダーとカートリッジ
  • 従来のHPLC機器と互換性があります。
  • レガシーHPLCカラム(Ultra、Pinnacle II、Pinnacle DB、Allure、Viva)で使用するよう設計されています。
  • 分析カラムへの取付けにはカプラーが必要です。
 

詳細については、LCガードカラム選択ガイドを参照してください。 

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21. UHPLCカラムに対応するRestekガードカートリッジはありますか?

Raptor 1.8 µm UHPLCカラム用のガードカートリッジおよびホルダをご用意しています。UHPLCには、インラインフィルターが有益な場合があります。 

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UltraShield UHPLCプレカラムフィルター

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UltraLine UHPLCインラインフィルター

Tridentダイレクトガードシステムと同様に、UltraShieldフィルターはインレット側のエンドフィッティングに直接取り付けます。UltraLineフィルターには、両側にチューブ接続が必要です。インジェクタとカラムの間に取り付ける場合は、EXPカプラーを推奨します。

UltraShieldフィルターとUltraLineフィルターのもう一つの違いは、フリットとフィルターにあります。UltraShieldユニットには、交換ができないチタンフィルターが付いています。したがって、フィルターアセンブリ全体が使い捨てのアイテムとして使用されます。 一方、UltraLineフィルターには交換可能なステンレススチール製フィルターがあり、必要に応じて多くのフィルターを注文することができます。

両方のユニットのフィルターは、0.5 µmの孔径を有し、両方のホルダーアセンブリは、15,000 psiの圧力まで漏れがありません。したがって、それらは機能的に同等です。

UltraShieldフィルターは、RestekUHPLCカラムのどのラインナップおよび固定相にも適合します。一方で、Raptor UHPLCガードは、1.8 µm Forceおよび1.9 µm Pinnacle DB UHPLCカラムにも使用できます。

F詳細については、LCガードカラム選択ガイドを参照してください。

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22. どのガードカートリッジを使用すればいいですか?

必要なガードカラムシステムがわかったら、次のステップは、分離カラムに合った充填剤とサイズを備えたLCガードカートリッジを選択します。選択性や効率を損なうことなく最大限の保護を得るために、分離カラムと同じ充填剤(固定相とシリカの両方)を含むLCガードカートリッジを選択する必要があります。例えば、Raptor Biphenyl 2.7 µm分析カラムに使用するための最適なLCガードカラムは、Raptor Biphenyl 2.7 µmガードカートリッジです。

分離カラムに合ったガードカートリッジ充填剤を選択することに加えて、正しい内径(ID)のLCガードカートリッジを選択する必要があります。一般的なルールとして、LCガードカラムのカートリッジIDは、分離カラムのIDと同じであるか、分離カラムのIDより1つサイズを小さくする必要があります。したがって、内径4.6または4.0 mmの分析カラムには内径4.0 mmのガードカートリッジを、内径3.2、3.0、2.1 mmの分析カラムには内径2.1 mmのガードカートリッジを使用することをお勧めします。

どのガードがどの分離カラムと互換性があるかについての詳細は、 LCガードカラム選択ガイドを参照してください。

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23. Tridentガードシステムで使用するキャップフリットはどれですか?

レベル1およびレベル3のTridentフィルターエンドフィッティングのキャップフリットは、より大きな粒子を捕捉し、ガードカートリッジの寿命を最大化します。フィルター孔径は、サンプルマトリクスの性質、および場合によっては移動相混合物の性質に基づいて選択されます。孔径2 µmのフリットは多くのケースで使用することができ、注文時の標準サイズです。0.5 µmのフリットは、事前にろ過処理されていない、またはサンプル調製時のクリーンアップが不足しているサンプルに対して、より多くの保護を提供します。 また、粒径3 µmの分析カラムを使用する場合や、より高濃度の緩衝塩を含む移動相を使用する場合は、より小さなフィルター孔径の方が有益な場合があります。

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24. 別メーカのカラムでRestekガードカートリッジを使用することはできますか?

充填材が非常に類似していれば、粒径サイズが3 µm以上の全多孔性粒子(FPP)カラムには、UltraまたはRocの5 µmガードカートリッジを使用することができます。「コアシェル」または表面多孔性粒子(SPP)の場合、同様の固定相、粒子サイズにRaptor 2.7 µmまたは5 µmのガードを使用できます。2 µm未満のFPPまたはSPP粒子の場合は、Raptor UHPLCガードカラムを同様の固定相に使用することができます。適切なRoc、Trident、またはRaptorガードホルダーを使用してください。簡単に参照できるように、Restekと同様のカラム固定相/充填剤の一部をこの表に示します: http://www.restek.com/Chromatography-Columns/HPLC-UHPLC-Columns/LC-Columns-Physical-Characteristics-Chart

場合によっては、固定相が非常に独特であるため、最良の結果を得るには、同じベンダーからガードカートリッジの消耗品を購入する必要があります。ご質問がございましたら、お気軽にお問い合わせください。

適切な接続を確保するために、RestekガードカートリッジにはRestekガードカートリッジホルダーのみを使用することをお勧めします。

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ハードウェア

25. HPLCカラムのエンドフィッティングにはどのサイズのねじ山がありますか?

すべてのHPLCおよびUHPLCカラム上のフィッティングには、10-32のねじ山があります。ただし、Waters、Rheodyne、SSI、Gasukuraのフィッティングとカラムは、ねじ山が10-32であるにもかかわらず、以下に示すように、フェラル長が異なる(座面が深い)ことがわかります。Restekのユニバーサル10-32PEEKカラムコネクタと新しい EXPフィッティングは、これらの構成のいずれにも対応します。 

フィッティングスタイルはメーカーによって異なりますが、すべてのHPLCおよびUHPLCカラムのフィッティングは10-32のねじ山です。

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Parker

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Valco

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Waters

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Rheodyne

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Swagelok
Parker A- Lok

 

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26. 「10-32」とはどういう意味ですか?

これは、米国規格協会(ANSI)によって採用された命名規則です。HPLCフィッティングの場合、最初の数字はナットのねじ部分の直径を示します(内側に入るチューブではありません)。下記の場合のように、直径が1/4インチ未満の場合は、ゲージの値が使用されます(ゲージ10)。ハイフンに続く数字は、1インチあたりのねじ山の数、すなわちねじ山の「ピッチ」を示します。外ねじ山のサイズと公差のチャートは、こちらから入手できます: http://www.engineersedge.com/screw_threads_chart.htm

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10ゲージのフィッティングの直径は約3/16インチです。

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サイズ10-32フィッティングのねじ山の数は、1インチあたり32山です。なお、最初のねじ部は、フィッティングの位置をゼロに揃えるために使用され、ねじ山の数には含まれません。

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27. 10-32以外に、LCに使用される他のサイズのねじ山はありますか?

おそらく10-32スレッドがHPLCで使用される唯一のねじ山です。ただし、実験室の設定や低圧接続に使用される¼ x 28またはM6(M6 x 1の略)フィッティングが時折見られることがあります。 ¼ x 28のねじ山はさらに離れており、直径がわずかに大きく、通常、より高い圧力にも耐えられません。M6フィッティングは、実際には直径6 mm、間隔1 mmのメートルねじです。 

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28. HPLC用ステンレススチールのフィッティングはポリマーベースのフィッティングとどのように異なりますか?

最も顕著な違いは、ステンレススチールのフィッティングがチューブを「かしめている」ことです。レンチで締め付けられ、ナットがしっかりと固定されると、フェラルはチューブに永久に取り付けられます。これにより、高圧に耐える良好なシールが得られますが、フェラルは取り外して再利用することはできません。フェラルを交換したり、新しいチューブに取り付け直したりするには、フィッティング全体とチューブの一部分を切断しなければなりません。フェラルを犠牲にするだけでなく、チューブの長さを少し短くする必要があります。(通常、ナットは引き続き再利用することができます。)

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ステンレススチールフィッティングが取り付けられたRestekキャピラリーステンレスチューブ (cat.# 26533)

Restekのユニバーサル10-32コネクタやハイブリッドフェラルEXPフィッティングなどのポリマーベースのものは、チューブを永久にかしめる必要がありません。したがって、すべての部品を再利用できます。EXPフィッティングは、フェラルがある程度再利用可能でありながら、より高い圧力に耐えることができるため、特に便利です。EXPフィッティングを再利用できる回数は、加えられるトルクの量に直接関係します。フェラルは、フィッティングを手締めすると何度でも再利用できますが、UHPLC用にフィッティングをレンチ締めする場合は、数回だけ再使用できます。この使用制限は、かしめによるものではなく、フェラルのある程度の変形によるものです。

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PEEK手締めフィッティング (cat.# 27710)

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29. UHPLCに使用できるフィッティングはどれですか?

UHPLCシステムに付属しているようなステンレススチールのフィッティングを使用するか、EXPフィッティングを使用することができます 。EXPフィッティングは、レンチ締めすると最大20,000 psiまで使用できます。いずれにせよ、UHPLCによってもたらされる高い効率が、余計なデッドボリュームによって損なわれないように、デッドボリュームがゼロのフィッティングを必ず使用してください。

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30. フィッティングを締めるにはどうすればよいですか?

RestekのポリマーベースのユニバーサルコネクタとPEEKユニオンコネクタは手で締めるだけですが、ステンレススチールのフィッティングはすべてレンチで締める必要があります。EXPフィッティングはどちらの方法でも使用できます。8,700 psiまでの使用には手締めし、20,000 psiまでの使用にはレンチ締めします。過度の締め付けは、かじりを引き起こし、ねじ山を損傷することに注意してください。レンチ締めする必要があるフィッティングは、一般に、リークのないシールを実現するために、手で締めた後に¼回転する必要があります。残念ながら、ユニバーサルなトルク設定はありません。 

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31. どのフィッティングをどのチューブに使用しますか?

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慣例では、フィッティングの材質をチューブの材料に一致させるように指示されています。PEEKフィッティングにはPEEKチューブを使用し、ステンレスチューブにはステンレススチールフィッティングを使用します。その主な理由は、単にシステムの圧力です。ただし、一部のステンレススチールフィッティングは、PEEKチューブと併用することができます。例えば、EXPフィッティングは、チタン/PEEKハイブリッド構造により、PEEKまたはステンレスチューブの両方に使用することができます。ただし、不活性度が考慮される場合は、ステンレススチールのフィッティングは避け、PEEKフィッティングの方が良い選択となります。PEEKは、王水などのいくつかの強酸溶液での使用は推奨されず、特定の条件下ではハロゲン化溶剤やTHFの影響を受ける可能性があることに注意してください。ステンレススチールは、ほとんどの移動相試薬および溶媒に対して安全ですが、特に無機酸、塩基、および酸化剤に対しては不活性ではありません。

EXPフィッティング はチタン/ PEEKハイブリッド構造を利用しており、PEEKまたはステンレスチューブのいずれかで使用できます。

PTFEおよびTygonチューブなどの他のタイプのチューブは、PEEKまたはポリエチレングリコール(PE)フィッティング、ユニオン、およびアダプターと共に良好に機能します。これらのフィッティングの多くは、低圧用途に使用されるため、スクリュー式ではなく、むしろスリップオン式になっています。この良い例は、ボトル/リザーバーからポンプへのHPLCにおける移動相の送液です。これは低圧送液であり(HPLCおよびUHPLCシステムはポンプからカラムの端まで高圧を保持します)、PTFEチューブとPTFEまたはPEフィッティングが一般的に使用されます。

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PEEKユニオンコネクタ (cat.# 27715)

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ブルーステムガラス溶媒フィルタ

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32. LCチューブの内径を知るにはどうすればよいですか?

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UHPLCシステムは、肉眼では識別できない非常に細い内径のチューブで配管されています。このため、チューブは内径に基づいてカラーコード化されています。Restekは、カラーバンドが付いたステンレススチールキャピラリーチューブを提供しています。赤= 0.005インチ、黄色= 0.007インチ、青= 0.010インチ、オレンジ= 0.020インチ。色分けはメーカーによって異なります。それは普遍的ではありません。ステンレススチールキャピラリーチューブは、お客さまによってではなく、製造業者によってカットされるべきであことに留意することも重要です。プロ仕様の機械加工カッターを使用しないと、きれいなスクエアカットを実現することは不可能です。事前にかしめたフェラル付きのステンレススチールフィッティングまたはハイブリッドフェラルを備えたEXPフィッティングは、ステンレスフィッティングチューブとともに使用し、最大20,000 psiまでUHPLCで漏れのないシールを実現します。

LCグレードのステンレススチールチューブの内径は、プレカットチューブに付属するカラーコードバンドで識別します。

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HILICメソッド

33. HILICメソッドの問題を回避するにはどうすればよいですか?

HILICモードは、とりわけ極性化合物の分析に対し有効な手段ですが、難しいモードでもあります。HILICモードにおける一般的なトラブルを避けるためには、いくつかの重要な考慮事項があります。私たちの技術記事では、HILICのテクニックを紹介し、頻繁に発生する問題について議論しており、HILICメソッドをラボのレパートリーにうまく組み込むことに役立ちます。

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34. Raptor HILIC-Siカラムは、箱から出してすぐに使用できますか?

使用する前に、RaptorHILIC-Siカラムを分析に使用する移動相で適切にコンディショニングする必要があります。イソクラティックのHILIC条件の場合、少なくとも50カラム容量を通液する必要があり、グラジエントのHILIC条件の場合、フルタイムプログラムで少なくとも10回のブランク注入を実施すべきです。移動相の組成や添加剤の濃度を変更する場合にも、コンディショニングが必要です。初めてカラムをコンディショニングしたときと同じカラム容量またはブランク注入回数を使用します。以下の表Iは、RaptorHILIC-Siカラムのカラム容量をサイズに基づいて示します。

表 I: Raptor HILIC-Siカラムのサイズに基づくカラム容量 (mL)

Column ID Column Length

30 mm

50 mm

100 mm

150 mm

2.1 mm

0.05

0.1

0.2

0.3

3.0 mm

0.2

0.4

0.5

4.6 mm

0.4

0.8

1.2

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35. 注入毎にRaptorHILIC-Siカラムを平衡化するには、どのくらいの時間を要しますか?

移動相によるカラムの初期コンディショニングに加えて、注入毎にカラムを再平衡化することが重要です。HILICメソッドの分離メカニズムには、粒子表面への水層の吸着が含まれるため、保持時間の再現性を確保するために、注入毎にこの水層を完全に再構築または「リセット」することが非常に重要です。グラジエントプログラムが初期条件に戻ったときに最低10カラム容量での平衡化、またはイソクラティック分離において、最後のピークの保持時間から少なくとも10カラム容量での平衡化を推奨します。完全な再平衡化に必要なカラム容量は、特にイソクラティック分離の場合、分析種に非常に依存する可能性があるため、HILICメソッド開発中に保持時間の再現性を調査することを確認してください。

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36. HILICモードに使用する注入溶媒は?

注入溶媒は、HILIC分離のために有機含有量が多い移動相の初期条件にできるだけ一致するようにする必要があります。注入溶媒を移動相の初期条件に一致させることにより、ピーク形状が改善され、保持が向上し、感度が向上します。

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37. HILICモードでは、どのようなpHの影響に注意する必要がありますか?

分析対象物の電荷状態に対するpHの影響は、各化合物のpKaによって異なるため、メソッド開発中にpHの影響を慎重に評価しなければなりません。HILICメソッドでは、移動相の有機溶媒比率が高いためpHが高くなる傾向があります。実際の移動相pHは水溶液中よりも1〜1.5程度高くなる場合もあります。カラム自体の電荷状態も影響を受ける可能性があります。例えば、Raptor HILIC-SiカラムではベアシリカのpKa が3.8~4.5であるため、移動相pHはシリカ表面の電荷を変化させ、酸性が非常に強い場合には中性状態に、pHが3.8以上なるとイオン化(負に電荷)します。このため一つ以上のプロトン化したアミンや第4級アンモニウム基を有する分析種には、Raptor HILIC-Siカラムが適しています。 

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38. HILICモードに緩衝液を使用できますか?どんな種類、濃度は?

多くのHILICモードでは検出器に質量分析計を使用するため、ギ酸アンモニウムや酢酸アンモニウムなどの揮発性緩衝塩が一般的に使用されます。ただし、移動相の有機溶媒比率が高いと、緩衝塩が沈殿する可能性があり、機器のメンテナンスにダウンタイムを招く可能性があります。さらに、緩衝液の濃度が高いと、分析対象物の保持を減少することによりクロマトグラフィーに影響を及ぼします。これらの影響を回避するために、メソッドの最適化が必要であり、10 mMが緩衝液濃度の適切な出発点です。グラジエント溶出中も質量分析計で安定した感度を得るためには、AとBと両方の移動相に等量の緩衝塩を加えておく必要があります。ESIイオン源に推奨される最大の緩衝塩濃度については、MSベンダーにお問い合わせください。

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PFASディレイカラム

39. PFASとは何ですか?

PFASは、消防用発泡剤、コーティング添加剤(例えば、焦げ付き防止の鍋やフライパン)、繊維(防水衣類、防汚カーペット)、および洗浄製品などの様々な製品の製造で界面活性剤として使用されるパーフルオロまたはポリフルオロアルキル化合物です。それらは環境中での分解に対して極めて安定であり、世界中の土壌、空気、地下水、都市ごみ、埋め立て地の浸出液で検出されています。最も一般的なPFASの2つは、パーフルオロオクタン酸(PFOA)とパーフルオロオクタンスルホン酸(PFOS)です。

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40. GenXとPFBSとは何ですか?

これらは、PFOAとPFOSを置き換えるために過去10年以内に製造された2つの化合物です。GenX(ヘキサフルオロプロピレンオキシド二量体酸のアンモニウム塩、または2009年に導入されたHFPO-DA)およびPFBS(2003年にリリースされたパーフルオロブタンスルホン酸)の安全性については、依然として健康と環境への懸念があり、多くの環境研究所がPFOAおよびPFOSと共にそれらについて試験し始めています。

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41. PFAS分析はどのようなラボで行われますか?

PFAS分析は、受託分析の環境ラボ、州および地方自治体のラボ、および地方自治体の水処理ラボによって行われます。PFAS分析を行う他のラボには、大学や食品および給水をテストする飲料ラボなどがあります。PFAS分析は最近、大気試験にも拡大されているので、大気管理のラボは、分析種リストにPFASを追加する可能性があります。

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42. 典型的なPFAS分析レベルはいくつですか?

PFASの検出レベルは、地域や飲料水、廃水、海水、土壌などのマトリックスによって異なります。飲料水は公衆衛生に関して最も懸念されるマトリックスであり、多くの環境機関が安全な消費レベルを設定しようとしています。多くは健康に基づく勧告レベルであり、2019年2月現在で規制はありません。現在、ほとんどの国で、飲料水中のほとんどのPFAS化合物について、懸念が示されたレベルは低いppt(ng/L)範囲にあります。 いくつかの例を以下に示します。

 

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43. 他のLC-MS/MS分析と比較して、PFAS分析は何が異なりますか?

LC-MS/MS分析は非常に高感度で選択的な手法であり、さまざまなアプリケーションで使用され、多成分分析に適しています。その化学的/物理的特性と長期間にわたる安定性のため、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)などのプラスチックフルオロポリマーが多くのLC-MS/MSの構成部品に使用されています。PTFEは、LCポンプシール、移動相のトランスファライン、デガッサで使用されるプラスチックライニングなどに含まれています。残念なことに、これらのプラスチック部品は、PFASを移動相に浸出する可能性があり、これは、微量レベルのPFAS分析を妨害するシステムに関連したPFAS汚染によるバックグラウンドを引き起こします。飲料水中のPFAS検出レベルはpptの範囲であるため、わずかな妨害でも定量分析にバイアスが生じる可能性があります。

PFASによる妨害は、PFAS化合物が広く使用されているため、移動相の調整に使用される溶媒(新しいボトルでさえ)からも発生する可能性があります。PFASは空気中にも見られるため、PFAS汚染物質は文字通りどこにでも低濃度で存在すると推測できます。基本的に、システム関連のPFASは、サンプル収集ボトル、移動相キャップ/ライニング(PTFE製)、溶媒入口チューブ(多くはFEPまたはPFA)、デガッサ、LCポンプ部品、オートサンプラーバイアルのセプタム(多くはPTFE/シリコン)を含むLC-MS/MSワークフローのすべての段階の構成部品に由来します。

観察される妨害の程度は、LC装置メーカーによって異なり、メソッドパラメータ(平衡化時間、溶媒選択、対象化合物など)によっても異なります。より長い平衡化時間はPFASがプラスチック部品から浸出する時間がより長くなるため、多くの妨害を生じることに注意してください。

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44. LCシステムにPFASの汚染があるかどうかは、どうすればわかりますか?

LCのPFAS汚染を特定する最も簡単な方法は、カラムに移動相を30分間送液して、システム関連のPFASをカラムの入口に蓄積させることです。それから、溶媒ブランクを注入し、グラジエント溶離を始めると、分析カラムに蓄積したPFASがカラムから溶出し、サンプル中のPFASが溶出する保持時間と一致して出現します。

次に、平衡時間を長くとって溶媒ブランクを注入した直後に別の溶媒ブランクを注入して、PFAS化合物の保持時間を確認します。この2回目の注入の目的は、システム関連のPFASが分析LCカラムに蓄積するのに十分な時間を与えないことです。

直ぐに注入したときの結果と、長い平衡時間をとって注入した結果と比較します。長い平衡時間をとった注入にPFASピークがあり、直ぐに注入した場合にピークがなければ、微量分析を妨害する可能性のあるシステム関連のPFAS汚染物質がLCに含まれていることになります。両方の注入でPFASの保持時間にピークがない場合は、装置にシステム関連のPFASの妨害があまりない可能性があります。これは、新しい質量分析計システムで古いLCユニットを使用している場合に起こる可能性があります。なぜなら、浸出可能なシステム関連のPFASの大部分がすでに浸出されているからです。ただし、この状態がずっと続くわけではありません。注入バルブの手間にあるいずれかのプラスチック構成部品を交換する場合に、新しい部品がPFASフリーでない限り、システム関連のPFAS妨害が浸出する可能性があります。

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45. システム関連のPFASをサンプルと分離することが重要なのはなぜですか?

正確な同定および定量のために、1兆分の1(ppt)のような非常に低いレベルでPFASを分析している場合、検出されたPFASがサンプルのみに帰属していることを確認する必要があります。LCからのバックグラウンドのPFAS汚染がサンプルのPFASと共溶出する場合、それらは妨害をし不正確な結果を引き起こします。 

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46. PFASディレイカラムはどのように役立ちますか?

PFASディレイカラムは、インジェクタの手前に取付けられ、システム由来PFASをトラップし、その溶出を遅らせます。これにより、サンプル中のPFASと共溶出すること、および干渉することを防ぎます。 機能的には、グラジエントが始まると、トラップしたPFASがディレイカラムから溶出され、次いで分析カラムに移動します。それらは、注入したサンプルのPFASの後に分析カラムに到達するため、サンプル中のPFASと共溶出しません。

サンプル中のPFASは、正常な形状の対称なピークとして溶出しますが、遅れて溶出するシステム由来のPFASは、グラジエントとともにシステム全体を連続的に移動しています。分析カラムで先端濃縮されることはないので、それによる「ピーク」が溶出するときは、単にベースラインが上昇するだけです。シグナルは、モニタリングしている化合物のMS/MSトランジションと一致するため、1つ以上のPFASに帰属することがわかっています。ただし、サンプル中の同じPFASの保持時間ウィンドウ以降であるため、サンプルの一部として検出および定量されません。

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