Comment bien choisir son tampon en mode HILIC ?

Description 

(Sous-titres disponibles en français)

La chromatographie liquide d’interaction hydrophile, ou HILIC, est un mode de chromatographie liquide (LC) servant à séparer des analytes polaires en utilisant des phases stationnaires polaires (elles aussi) et des conditions initiales de phases mobiles à fort pourcentage de solvant organique. Les tampons sont très importants en mode HILIC car les états d’ionisation des analytes ET des phases stationnaires vont impacter la séparation. Nous vous expliquons ici comment optimiser les concentrations de ces tampons.

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Transcription

Quand vous commencez votre développement de méthode HILIC, vous devez choisir les phases mobiles appropriées. Une bonne séparation en mode HILIC dépend des états d’ionisation de la phase stationnaire ET des analytes, qui sont contrôlés par le pH des phases mobiles. 

Pour commencer, nous recommandons de préparer au moins 3 phases mobiles aqueuses à différents pH. La première est du formiate d’ammonium 10mM ajustée à pH 3 avec une solution d’acide formique. La seconde est de l’acétate d’ammonium 10mM ajustée à pH 5 avec une solution d’acide acétique, et la troisième est de l’acétate d’ammonium 10mM ajustée à pH 6.8 avec une solution d’acide acétique. 

En travaillant en isocratique ou en gradient avec des conditions initiales à 90 – 95% d’acétonitrile, vous devriez savoir quel pH est le plus approprié simplement en regardant les formes/symétries des pics. Une fois le pH de la phase mobile déterminé, vous pouvez ensuite optimiser la méthode en ajustant la concentration du tampon et des conditions d’élution. Parfois, vous constaterez qu’une concentration de tampon plus élevée peut donner de meilleures formes/symétries de pics. Mais gardez bien en tête que le sel contenu dans le tampon peut précipiter en présence d’une forte teneur en solvant organique. Enfin, pour les élutions de gradient, une bonne pratique consiste à tamponner la phase mobile aqueuse ET la phase mobile organique pour garder une force ionique constante durant le temps de l’analyse. Si vous prenez soin de bien sélectionner le pH et la concentration du tampon de vos phases mobiles, vous commencez alors dans les meilleures conditions.  

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