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Tipps zur Herstellung von Standards für Kalibrierkurven und zur Vermeidung von Fehlerquellen

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Korrekte Kalibrierdaten sind die Grundlage jeder Quantifizierung. Aber hinter jeder guten Kalibrierkurve steckt eine enorme Menge Arbeit. Hinter jeder Ecke lauern zahlreiche potenzielle Fehlerquellen. Deshalb ist es wichtig, sich damit vertraut zu machen, wie man Genauigkeit und Richtigkeit am besten sicherstellen kann. Um Frustrationen über fehlerhafte Kalibrierkurven, Projektverzögerungen und Verschwendung von Zeit und Ressourcen zu vermeiden, möchten wir Ihnen einige Tipps geben, die Ihnen helfen sollen, einige der Fallen zu vermeiden, die bei der Herstellung von Standards für Kalibrierkurven auftreten können. Obwohl es viele Geräteprobleme gibt, die zu einer inakzeptablen Kalibrierkurve führen können, befasst sich dieser Artikel hauptsächlich mit der Herstellung und Lagerung der Standards.

Vor Beginn sollten Sie sicherstellen, dass Sie mit den Regeln und Richtlinien (SOPs, Vorschriften, Standardrichtlinien usw.) Ihres Unternehmens vertraut sind und die SDB sowie die Entsorgungsauflagen für die von Ihnen verwendeten Chemikalien kennen. Die Priorisierung von Compliance und Sicherheit ist entscheidend für effizientes und effektives Arbeiten. Wenn Sie aufgrund dieser Tipps Möglichkeiten zur Verbesserung bestehender Praktiken sehen, sollten Sie deshalb zunächst mit Ihrem Vorgesetzten sprechen, bevor Sie irgendwelche Verfahren ändern.

Korrekte Nutzung von Geräten und Ausrüstung

Während die meisten Methoden die Verbindungen und Konzentrationen vorschreiben, die Sie herstellen müssen, liefern sie normalerweise keine Best Practices für das eigentliche Mischen Ihrer Standards. Der erste Schritt bei der Erstellung einer guten Standardkurve besteht darin, dass Sie sich mit Ihren Geräten und Ihrer Ausrüstung vertraut machen und verstehen, wie man sie richtig verwendet. Es mag banal erscheinen, aber die Kenntnis der Funktionsweise der Geräte und Ausrüstung und die Anwendung guter Labortechnik sollten niemals als selbstverständlich hingenommen werden. Machen Sie sich mit den Ihnen zur Verfügung stehenden Gerätschaften vertraut und üben Sie deren korrekte Handhabung, bis Sie die Technik beherrschen. Nur weil Sie ein ähnliches Gerät schon einmal benutzt haben, heißt das nicht, dass das neue Gerät genauso funktioniert.

Automatische Pipetten sind ein gutes Beispiel dafür: Sie erfüllen alle ihre Aufgabe, aber sie funktionieren nicht alle genau gleich, und die Erfahrungen mit einer Pipette lassen sich nicht immer auf eine andere übertragen (Abbildung 1). Hier ein paar kleine, aber wesentliche Dinge, die Sie beachten sollten, wenn Sie Standards für Kalibrierkurven mithilfe von Pipetten herstellen.

  • Luftpolstersysteme gegenüber Direktverdrängungssystemen
    Luftpolsterpipetten sind empfindlich gegenüber dem Dampfdruck der Flüssigkeit, die Sie messen. Sie werden in der Regel mit Wasser kalibriert, so dass Flüssigkeiten mit höherem oder niedrigerem Dampfdruck, deren Volumen mithilfe einer Luftpolsterpipette bestimmt wird, ein anderes Volumen besitzen, als die Pipette anzeigt. Wenn Sie korrekte und präzise Volumina von Flüssigkeiten benötigen, die einen anderen Dampfdruck als Wasser aufweisen, sollten Sie eine Direktverdrängungspipette verwenden oder den Unterschied kompensieren, indem Sie Ihre Luftpolsterpipette gravimetrisch auf die korrekte Einstellung für die jeweilige Flüssigkeit kalibrieren.

  • Manuell betätigte Systeme gegenüber elektrisch betätigten Systemen
    Manuelle Pipetten erfordern Konsistenz seitens des Benutzers. Die Einstellung des Pipettenvolumens und die Gewährleistung identischer Aliquote ist entscheidend für konsistente Ergebnisse, da schon eine kleine Drehung oder ein Stoß ausreichen kann, um die Volumeneinstellung zu verändern. Sie müssen außerdem darauf achten, dass Sie bei der Aufnahme und Abgabe von Flüssigkeiten an den Widerstandspunkten den gleichen Druck auf den Kolben ausüben. Elektrische Pipetten zeigen bei der Handhabung eine geringere Tendenz “abzudriften”, aber sie bestimmen den Arbeitsrhythmus, und der Benutzer muss ihrem Tempo folgen.

Abbildung 1: Pipetten gibt es in vielen verschiedenen Ausführungen, z. B. mit manuellem oder elektrischem Antrieb und als Luftpolster- oder Direktverdrängungspipetten. Die Kolbengrößen können sich ähnlich anfühlen; prüfen Sie deshalb immer, dass Sie den korrekten Volumenbereich und die korrekte Spitzenart gewählt haben.

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Elektronischer Antrieb, Luftpolsterpipetten Manueller Antrieb, Direktverdrängungspipetten
  • Arten von Pipettenspitzen
    Die Anpassung der richtigen Spitze an die richtige Pipette ist äußerst wichtig. Nur weil eine Pipettenspitze auf eine bestimmte Pipette passt, bedeutet das nicht immer, dass es die richtige ist. Die Spitzen sind in der Regel farbcodiert, aber es lohnt sich trotzdem zu überprüfen, ob die Spitze zur Pipette passt.

  • Kalibrierung
    Pipetten bleiben nicht unbegrenzt kalibriert. Stellen Sie sicher, dass sie regelmäßig professionell kalibriert werden, abhängig vom Bedarf oder den Anforderungen Ihres Labors und in Übereinstimmung mit dem Qualitätsmanagementprogramm Ihrer Organisation. Es ist immer gute Praxis, die Kalibrierung Ihrer Pipette vor der Verwendung gravimetrisch mit Wasser zu überprüfen.

  • Benetzung der Spitze
    Verdrängungspipettenspitzen neigen dazu, beim ersten Befüllen Luftblasen zu enthalten. Durch mehrmaliges Befüllen und Evakuieren vor der Verwendung können Blasen entfernt werden, die das abgegebene Volumen beeinflussen. Außerdem können Luftpolsterpipettenspitzen aufgrund eines Benetzungseffekts bei der Erstbefüllung ein etwas anderes Volumen aufweisen als bei nachfolgenden Messungen. Deshalb sollten Sie auf eine konsistente Technik achten.

  • Pipettiertechnik
    In den meisten Fällen sollten die Pipettenspitzen knapp unter der Oberfläche der Flüssigkeit platziert werden. Ein zu tiefes Eintauchen der Pipettenspitze in die Flüssigkeit kann dazu führen, dass vor der Aufnahme zusätzliche Flüssigkeit in die Pipettenspitze gelangt und so das gemessene Volumen erhöht. Außerdem sollte die Pipette senkrecht zur Flüssigkeitsoberfläche und nicht schräg gehalten werden. In einer internen Studie haben wir korrekte und unsachgemäße Pipettiertechniken verglichen, und die unsachgemäße Technik führte zu einer fast neunmal höheren Standardabweichung (Abbildung 2).

Abbildung 2: Minimieren Sie Fehler durch eine korrekte Pipettiertechnik: Halten Sie die Spitze immer senkrecht zur Flüssigkeitsoberfläche und knapp darunter. Schräghalten der Pipette oder ein zu tiefes Eintauchen in die Flüssigkeit kann zu ungenauen Volumina führen.

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  • Austausch der Pipettenspitze
    In den meisten Fällen sollten Pipettenspitzen nach dem Gebrauch ausgetauscht werden, da durch ihre Wiederverwendung Verunreinigungen in nachfolgende Messungen gelangen können. Wenn Sie denken, dass die Spitze möglicherweise kontaminiert wurde, sollten Sie sie entsorgen.

  • Volumenbereich
    Um Fehler zu reduzieren, ist das untere Ende des Volumenbereichs der Pipette möglichst zu vermeiden. Außerdem sollen Sie eine Pipette verwenden, deren Bereich eher dem Volumen entspricht, das Sie abgeben möchten. Wenn Sie z. B. 10 µL abgeben müssen und die Wahl zwischen einer Pipette mit 1-10 µL und einer Pipette mit 10-100 µL haben, sollten Sie die Pipette mit 1-10 µL wählen, da der Fehler dieser Pipette für ein Aliquot von 10 µL normalerweise geringer ist als der Fehler der Pipette mit dem größeren Volumenbereich.

  • Vermeiden Sie die Abgabe von sehr kleinen Volumina konzentrierter Lösungen
    Wenn Sie eine konzentrierte Stammlösung haben, die Sie verdünnen, um Ihre Kalibrierstandards herzustellen, und Sie sehr kleine Volumina verwenden müssen, um die Kalibrierstandards mit den niedrigsten Konzentrationen herzustellen, sollten Sie in Erwägung ziehen, eine intermediäre Stammlösung herzustellen, die es Ihnen ermöglicht, ein größeres Aliquot zu verdünnen, um die Kalibrierstandards mit den niedrigsten Konzentrationen herzustellen.

Welche anderen Laborgeräte verwenden Sie routinemäßig bei der Herstellung von Standards für Kalibrierkurven? Vortex-Mixer und Ultraschallbäder werden häufig zum Mischen von Standards eingesetzt. Um Homogenität zu erzeugen, müssen sie jedoch korrekt verwendet werden. Wenn Sie z. B. einen Vortex-Mixer verwenden, ist darauf zu achten, dass ausreichend Platz im Fläschchen vorhanden ist, damit sich die Lösung effektiv mischen kann. Die Bildung eines kleinen Wasserwirbels in der Flüssigkeit zeigt an, dass ausreichend Platz für eine gründliche Durchmischung vorhanden ist. Schütteln oder Ultraschallbehandlung kann ebenfalls funktionieren, dauert aber etwas länger. Bei der Ultraschallbehandlung ist zu beachten, dass thermisch labile Verbindungen abgebaut werden können, da sich die Lösung während der Beschallung erhitzen kann. Bei Fragen zu Geräten und Ausrüstung sollten Sie Ihre Kollegen, Handbücher, Internetressourcen oder Gerätehersteller konsultieren, um zu lernen, wie man die für die Herstellung von Standards für Kalibrierkurven benötigten Geräte korrekt verwendet.

Stabilitätsprobleme beachten

Verwenden Sie bei der Herstellung von Arbeitsstandardlösungen immer hochwertige Ausgangsmaterialien, die auf Stabilität ausgelegt sind.  Eine einfache Möglichkeit, stabile Stammlösungen und Spezialgemische für Ihre Liste von Zielanalyten zu finden, ist ein Besuch bei www.restek.com/solutions. Einige Hersteller von Referenzstandards, darunter auch Restek, lassen sich ISO zertifizieren, um zu bestätigen, dass Verfahren vorhanden sind, die sicherstellen, dass die angegebene Konzentration bis zum Verfallsdatum des Produkts korrekt ist (sofern es gemäß den angegebenen Anweisungen gelagert und gehandhabt wird).
Sobald jedoch ein Referenzmaterial geöffnet und mit anderen Standards oder Lösemitteln gemischt wird, können im Laufe der Zeit chemische Reaktionen auftreten, die zu einem Abbau führen, wodurch Ihre hergestellten Kalibrierstandards von Tag zu Tag oder sogar von Stunde zu Stunde inkonsistent werden. Das in Abbildung 3 gezeigte Beispiel veranschaulicht, wie das Pestizid Carboxin, das in der gekauften Stammrezeptur stabil ist, im Laufe der Zeit abgebaut werden kann, wenn es Teil eines hergestellten Kalibrierstandards für Mehrfachrückstände von Pestiziden ist.

Es kann auch Temperatur- oder Lichtempfindlichkeiten geben, die berücksichtigt werden müssen, insbesondere bei der Lagerung. Sie müssen bestimmen, wie lange die neuen Mischungen stabil sind, um sicherzustellen, dass sie bei ihrer Verwendung korrekte Kalibrierkurven ergeben. Führen Sie im Vorfeld Stabilitätsstudien durch, damit Sie genau wissen, wie Sie die Arbeitsstandards handhaben und lagern müssen und wie lange sie präzise und korrekte quantitative Ergebnisse liefern werden. Denken Sie daran, dass unterschiedliche Konzentrationen unterschiedlich schnell abgebaut werden können.

Abbildung 3: Abbau von Carboxin in einem hergestellten Kalibrierstandard für Mehrfachrückstände von Pestiziden (1 ppb Ausgangskonzentration).

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Carboxin ist in einem 30-Komponenten-Pestizid-Standard (Art.-Nr. 31976) enthalten, der Teil eines 10 Ampullen umfassenden LC-Kits für Mehrfachrückstände von Pestiziden mit 204 Analyten (Art.-Nr. 31971) ist, wobei jede Ampulle eine Lösung enthält, die speziell für maximale Langzeitstabilität formuliert und gruppiert wurde. Ein 1 ppb-Kalibrierstandard, der alle Kitkomponenten enthält, wurde in einem Gemisch aus wässrigem Sellerieextrakt und Acetonitril (90:10) hergestellt, um die Wichtigkeit der Prüfung einzelner Komponenten in komplexen Kalibriergemischen in Abhängigkeit von der Zeit darzustellen.

Neben der Stabilität kann auch die Löslichkeit des Analyten ein Problem darstellen. Wenn Sie mit Verbindungen arbeiten, die im Verdünnungslösemittel nicht gut löslich sind, kann dies zu erheblichen Kalibrierproblemen führen. Recherchieren Sie immer die Analytchemie, um zu bestätigen, dass die Verbindungen und ihre diversen Kalibrierkonzentrationen in den hergestellten Lösungen sowohl löslich als auch stabil sind.

Festlegung eines ausfallsicheren Arbeitsablaufs

Die vorzeitige Erstellung eines schriftlichen Arbeitsablaufs für die Herstellung der Standards von Kalibrierkurven macht die Arbeit im Labor deutlich effizienter. Die Verwendung eines Arbeitsblatts mit vorberechneten Volumina und Konzentrationen zur Dokumentation der Arbeitsschritte ist eine gute Praxis, die sicherstellt, dass Sie keine Schritte vergessen oder eine falsche Menge hinzufügen. Es ist eine gute Möglichkeit, für die Mengen an erforderlichen Chemikalien und Lösemitteln zu planen und den Ablauf im Voraus zu visualisieren.

Das Hinzufügen eines farbcodierten Arbeitsblatts zu Ihrem Arbeitsablauf ist eine einfache Möglichkeit, eine zusätzliche Sicherheitsebene zu schaffen. Verwenden Sie Farben, um Referenzmaterialien, konzentrierte Stammlösungen und endgültige Standards verschiedener Kalibrierkonzentrationen zu verknüpfen. Es ist leicht, das falsche Fläschchen oder die falsche Ampulle zu greifen, wenn alles gleich aussieht. Wenn Sie die Farben der Zellen Ihres Arbeitsblatts mit den in Ihrem Labor verwendeten Etiketten oder Verschlüssen abstimmen, können Sie die Fehlerwahrscheinlichkeit minimieren. Wenn Sie Ihren Arbeitsablauf erstellt haben, drucken Sie ihn aus, nehmen Sie ihn mit ins Labor und halten Sie ihn zur Bezugnahme bereit, während Sie arbeiten (Abbildung 4).

Abbildung4: Die Verwendung eines vorberechneten, farbcodierten Arbeitsablaufs für die Herstellung von Lösungen mit Kalibrierstandard und die Verschiebung der Fläschchen in einem Fläschchenständer zur Verfolgung des Verfahrensablaufs ist 
eine einfache Möglichkeit zur Vermeidung kostspieliger Fehler.

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Wenn Sie bereit sind, mit der Arbeit im Labor zu beginnen, überprüfen Sie zunächst alle Mengen an Chemikalien, Lösemitteln und Verbrauchsmaterialien, um sicherzustellen, dass Sie von allem genug haben. Beginnen Sie dann, den Arbeitsablauf zu befolgen, den Sie erstellt haben. Bauen Sie bei jedem Arbeitsschritt eine Art System ein, mit dem Sie die erledigte Arbeit verfolgen können. Es kann zum Beispiel sein, dass Sie 10 oder mehr Kalibrierkonzentrationen herstellen, jede mit unterschiedlichen Referenzmaterialien, Stammlösungen, Lösemitteln und/oder internen Standards. In dieser Situation ist es sehr hilfreich, mit einem Fläschchenständer zu arbeiten, so dass Sie, sobald ein Schritt für ein bestimmtes Fläschchen abgeschlossen ist, dieses in eine andere Reihe verschieben können, um anzuzeigen, wo Sie sich im Verfahren befinden. Kollegen stellen Fragen, Sie erhalten Telefonanrufe ... es gibt zahlreiche mögliche Unterbrechungen und Ablenkungen, die es schwer machen können, zu wissen, wo Sie aufgehört haben. Wenn Sie die Farbcodierung verwenden und sich an eine Routine halten, die Ihnen hilft, Ihren Fortschritt zu verfolgen, hilft dies enorm, um zu vermeiden, dass Sie den falschen Standard zur falschen Kalibrierkonzentration hinzufügen oder sogar versehentlich einen Schritt überspringen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass bei der Herstellung von Standards für Kalibrierkurven die Minimierung potenzieller Fehlerquellen für eine korrekte Quantifizierung unerlässlich ist. Die Beachtung der hier besprochenen Strategien - und das Stellen von Fragen, wenn es nötig ist - ist ein ausgezeichneter Weg, um Probleme zu vermeiden und gute Ergebnisse zu garantieren. Die Zeit, die Sie damit verbringen, sich mit den Geräten vertraut zu machen, die richtige Technik zu entwickeln, die Stabilitäts- und Löslichkeitsgrenzen zu verstehen und einen ausfallsicheren Arbeitsablauf zu entwickeln, ist eine gute Investition, die die Sicherheit Ihrer analytischen Ergebnisse erhöht.

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